小麦6A染色体影响产量及发育的单元型区段解析

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小麦基因组庞大而复杂,基因克隆进展落后于其它作物,相关深入研究还很匮乏,控制产量性状的基因更是如此。因此,探索简便、有效的方法对产量相关基因进行克隆和分析,并将其有效的应用于实际育种中具有重要的理论和现实意义。本文利用模式植物的遗传图谱、QTL信息与小麦基因组测序结果,解析6A染色体上产量相关区段Xgpw7592-Xcfe273:通过开发步移标记对该区段进行多样性和关联分析研究,逐步缩小关键基因所在区域,并确定候选基因;在此基础上,通过基因表达模式分析、亚细胞定位及转基因等方法研究了候选基因的功能,获得优异等位变异,并开发相应功能标记,主要研究结果如下:1.筛选小偃54和矮败中国春BAC文库,获得含cfe273和gpw7592标记的阳性克隆:其大小分别为160kb和20kb左右。根据阳性克隆插入片段的注释基因,锚定水稻及短柄草的同源功能区段。水稻同源功能区段为Os2g04750-Os2g06640,含有170个注释基因;短柄草同源功能区段为Bd3g03467-Bd3g04730,含有136个注释基因,两者同源的基因为124个;功能区段在水稻、短柄草和大麦间保持良好的共线性关系;与短柄草和水稻相比,大麦存在染色体片段的倒位和易位。2.根据禾本科植物染色体共线性及A和D基因组供体测序信息,开发了25个染色体步移标记,扫描小麦微核心种质及核心种质中的育成品种进行功能区段多样性和关联分析研究。多样性分析发现功能区段内具有V字选择谷,其中存在两个多样性极低的位点:结合连锁不平衡(Linkage Disequilibrium)分析将相关区段分解为两个功能区域HapB-6A-1和HapB-6A-2;关联分析表明其分别与抽穗期、成熟期、有效分蘖和千粒重等性状显著相关。3.参考水稻基因组注释信息,采用WEGO、Blast2go和KEGG进行蛋白注释,选定Os02g05470和Os02g05510两个CCT家族基因作为HapB-6A-1的候选基因;HapB-6A-2同源区段中含3个与生长发育相关基因,分别是转录延伸因子Os02g04160、MYB转录因子Os02g04640和生长素响应因子Os02g04810。4.在小麦中克隆了水稻Os02g05470的同源基因,命名为TaCCT-6A。对TaCCT-6A的编码区和启动子区进行了多态性分析,并将其定位于小麦6A染色体PSP3071和WMC306之间。TaCCT-6A编码区存在3个SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点,均位于内含子区;启动子区发现5个SNP和1个InDel位点。因此,可将TaCCT-6A分为Hap-6A-1和Hap-6A-2两种单元型。Hap-6A-1和Hap-6A-2在-958bp处存在1个SNP(T/C),恰好位于光反应元件SPl内,可能引起该元件失活。关联分析表明TaCCT-6A与花期、穗粒数和有效分蘖等多个产量性状显著相关;过表达TaCCT-6A的拟南芥植株营养生长显著增强,花期提前5天左右:近等基因系中研究发现TaCCT-6A-2对穗粒数具有正向贡献。亚细胞定位表明TaCCT-6A位于细胞核:TaCCT-6A昼夜表达节律明显,在苗期叶和生长锥及抽穗期穗、旗叶和叶鞘等组织中表达量较高。此外,优异单元型TaCCT-6A-2在我国小麦育种进程中经历了正向选择。5.染色体定位结果表明Os02g05510的同源基因(TaCCT-7A)定位于第7部分同源群,可能是物种分化过程中染色体重排导致;该基因gDNA和CDS序列长度分别为6kb和1.2kb,在细胞核中表达,在苗期的叶和幼穗中表达量最高,具有昼夜节律表达规律。转基因拟南芥实验结表明:长光照条件下,阳性株系较对照花期提前4天左右,且长势繁茂。相关实验结果表明TaCCT-7A是光周期基因,参与小麦光反应和生长发育的过程。6.与小麦A基因组供体序列比对,获得TaCCT-6A-2区段候选基因生长素响应因子(TaARF)的gDNA和ORF序列;缺体-四体染色体定位显示TaARF位于第6部分同源群。部分同源群间存在选择性剪接,TaARF1序列最长,为3408bp;与TaARF1相比,TaARF2含有两个9bp的缺失,未引起移码突变;TaARF3在1004bp处存在710bp缺失,造成无义突变,编码蛋白缺失Ⅳ功能域。该基因亚细胞定位于胞核中,为组成型表达,在幼穗及灌浆初期的籽粒中表达量较高,推测TaARF参与穗部与籽粒发育过程。转基因拟南芥阳性植株的花期不变,营养生长和生殖生长受表达量影响较大。7.HapB-6A-2区段候选基因TaTEF和TaMYB定位于小麦第7部分同源群上,再次证明同源功能区段在物种分化中发生了染色体重排;序列分析表明TaTEF-7A在品种间在启动子区存在14个SNP和2个InDel位点,形成3种单元型;定位结果显示TaTEF-7A与多个已报道的产量QTL相关重叠;TaTEF-7A亚细胞定位于细胞核中,各组织中均有表达,但在幼穗及灌浆期的籽粒中表达量较高;过表达TaTEF-7A的拟南芥阳性植株营养生长显著加强,籽粒变大,且果荚数目和长度都有所增加。关联分析和近等基因系结果表明TaTEF-7A参与控制小麦产量性状的形成和发育,且hAP-7A-3具有增加穗粒数的效应,其表达量与小麦穗粒数正相关,在育种过程中经历了正向选择。
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