猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一种重要的人畜共患病原菌,可以引起脑膜炎、心内膜炎和关节炎在内的剧烈炎症反应,导致人和猪的急性中毒性休克、败血症和死亡。在猪链球菌的33种血清型中,猪链球菌2型（SS2）是毒力最强、感染率最高的血清型。1998年和2005年,我国江苏和四川曾经爆发两次大的疫情,导致229人感染、52人死亡及大量的生猪发病死亡。2005年以来我国猪群SS感染率和发病率居高不下。2005年我国首次发现SS感染也可以引起“链球菌中毒性休克样综合症（streptococcal toxic shock like syndrome,STSLS）”,因此,STSLS发生机制成为SS致病机制领域的研究热点,并在过去十年取得了重要进展。然而,SS是如何逃逸免疫系统的监视并在血液和全身组织器官中快速繁殖,仍然缺乏系统研究。补体系统是构成宿主第一道免疫防线的先天性免疫的重要组成部分,并在先天性免疫与获得性免疫之间起着桥梁作用。补体系统可以快速识别和清除病原微生物,然而,病原微生物也进化出多种机制逃避补体系统的攻击。补体逃逸（complement evasion）是病原菌免疫逃逸的重要机制之一。本研究鉴定了运用双杂交技术从猪链球菌的表面蛋白和分泌蛋白中鉴定了多种补体结合蛋白,其中C1q的结合蛋白SntA是SS的一种含血红素的细胞壁锚定蛋白,具有核苷酸酶和核酸酶酶活性,在革兰氏阳性菌中高度保守,本论文深入研究了SntA介导的SS免疫逃逸及其机制。1.猪链球菌补体结合蛋白的筛选补体是存在于血清、组织液和细胞膜表面的不耐热的经活化后具有酶活性的一类蛋白质。补体系统主要通过经典途径、旁路途径和凝集素途径激活,实现补体活化,形成具有50多种补体蛋白和受体的补体相互作用网络。病原微生物的某些蛋白质获其他成分可以与补体组分结合,干预补体激活途径的不同阶段,通过捕获、切割、阻断等多种机制抑制补体的激活,逃逸补体的监视。因此,病原微生物补体结合蛋白的鉴定对研究其补体逃逸机制很重要。本研究分别以补体C1q A、C3a和C3b为诱饵,从SS2全ORFome（含SS2基因组的2100个ORFs）的细菌双杂交文库中,运用细菌双杂交技术筛选这些补体的结合蛋白,筛选到候选C1q A结合蛋白2个（B9H01＿RS05865;B9H01＿RS10100）,C3a结合蛋白4个（B9H01＿RS01440;B9H01＿RS10115;B9H01＿RS10100;B9H01＿RS03990）,C3b结合蛋白1个（B9H01＿RS09920）。这些补体结合蛋白的鉴定对深入研究SS的补体逃逸机制奠定了的基础。2.猪链球菌表面蛋白SntA介导的补体逃逸机制本实验室前期研究发现SntA是猪链球菌的一种血红素结合蛋白,能够和宿主抗氧化蛋白AOP2相互作用抑制宿主的抗氧化活性,导致感染猪的病理损伤（Wan et al.,2017）。本研究发现,SntA还可以与补体C1q结合,暗示SntA可能介导SS的补体逃逸或补体激活。为了深入研究SntA在补体激活或逃逸中的作用,本研究在本实验室已有的snt A突变菌株（Δsnt A）的基础上,构建了遗传互补菌株CΔsnt A。小鼠致病性和竞争性定植实验发现亲本菌株SC-19的致病性以及定植在小鼠血液、脑、肺和肾组织的能力显著高于Δsnt A菌株。抗吞噬实验发现Δsnt A菌株在全血、血清、RAW264.7吞噬细胞和人中性粒细胞PMNs中的存活能力显著低于亲本菌株SC-19和互补菌株CΔsnt A,揭示SntA具有显著的抗吞噬能力。细菌表面的补体沉积和攻膜复合物形成实验发现,Δsnt A菌株表面上的C3沉积量和攻膜复合物形成量均显著高于SC-19和CΔsnt A。补体介导的溶血实验证明SntA能够显著抑制补体经典激活途径介导的溶血活性。补体活化实验发现SntA蛋白自身能够激活补体的经典途径和凝集素途径,从而消耗有效的补体组分。直接和间接结合实验证实SntA能够与补体C1q互作,进而抑制C1q-Ig G、C1q-抗原抗体复合物的结合。本研究证实了SntA通过与C1q结合抑制补体经典激活途径介导的溶血活性;以及自身激活补体经典途径和凝集素途径从而消耗补体组分两种实现补体逃逸的机制。这两种补体逃逸机制对解析猪链球菌的致病性至关重要。3.核苷酸酶SntA调控猪链球菌在血液中的存活能力破坏宿主嘌呤信号通路是病原微生物逃避宿主免疫系统识别和杀伤的其中一项有效策略。本研究通过生物信息学分析鉴定了猪链球菌的编码5’-核苷酸酶的同源基因snt A。多序列比对结果说明SntA与已知5’-核苷酸酶具有高度的氨基酸序列相似性,且具有5’-核苷酸酶的特征性信号序列,推测SntA在猪链球菌宿主免疫方面具有重要的功能。体外酶活性检测实验发现SntA具有ATP酶活性和ADP酶活性,但不具有AMP酶活性。全血杀伤实验和PMNs杀伤实验发现,5’-核苷酸酶抑制剂能够显著下调SC-19和CΔsnt A在全血中的存活能力,而对Δsnt A的存活能力没有显著影响;腺苷能够显著上调Δsnt A菌株在全血和PMNs中的存活能力。此外,DNA降解实验发现,SntA还具有水解双链DNA的能力。本研究证实了SntA具有核苷酸酶活性和核酸酶活性,并通过其核苷磷酸酶活性提高猪链球菌在血液中的存活能力。4.SntA对猪链球菌环境适应性的影响在SS2致病过程中,许多蛋白直接或间接地参与了这个过程,主要包括表面相关蛋白和分泌蛋白。许多LPXTG基序锚定蛋白被认为是毒力因子,但其影响毒力的机制尚不清楚。前期研究发现,SntA是一个带有LPx TG基序的细胞壁锚定蛋白,且与猪链球菌致病性有关。本研究通过生长曲线测定实验发现,猪链球菌Δsnt A菌株的生长在OD和CFU上都与SC-19和CΔsnt A没有明显区别。应激反应实验发现SntA不影响猪链球菌耐高渗、低渗和高温的应激能力。生物被膜形成实验发现SntA不影响猪链球菌生物被膜的形成。透射电镜实验发现亲本菌株SC-19和Δsnt A菌株的荚膜并无显著变化。扫描电镜结果显示,Δsnt A菌株的形态有明显异常。细菌的粘附和侵入实验发现,Δsnt A菌株粘附和侵入Hep-2上皮细胞的能力显著强于SC-19和CΔsnt A。本研究证实了SntA影响猪链球菌的形态以及粘附和侵入宿主细胞的能力,从而进一步阐释SntA对猪链球菌致病性的影响。