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第一部分大鼠海马脑片培养方法的建立及细胞反应性研究目的:离体培养大鼠海马脑片并初步探索其细胞的反应性。方法:选择生后6～9d的Wistar鼠,分离海马,切成400μm厚的脑片,转移至带有微孔膜插件的6孔培养板内,入37℃的CO2培养箱中进行培养。通过肉眼、倒置相差显微镜观察培养海马脑片的形态学变化;用免疫组化染色检测脑片神经细胞内Fos蛋白表达变化,以判断陪养脑片有无对外界伤害性刺激的应激反应能力;用膜片钳技术检测神经细胞的电生理活动,以判断培养海马脑片的活性和生理功能。结果:(1)随着体外培养时间延长,培养脑片内神经细胞数目增多,而脑片明显变薄,至培养4周时厚度约150μm厚。(2)致癫痫样发作药物匹罗卡品作用于脑片后,导致培养海马脑片CA1区细胞内Fos蛋白表达增高。(3)利用膜片钳技术,在培养1、2、3、4周的4个时点对海马脑片CA1区锥体细胞作全细胞记录,皆记录到细胞电流变化图形。结论:本方法培养的海马脑片可存活4周,且具备良好的活性和一定的生理功能。第二部分BDNF对培养大鼠海马脑片痫性发作后损伤的作用目的:观察痫性发作对体外培养海马脑片的损伤作用,研究脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)对损伤海马神经元的作用。方法:以培养11天的海马脑片为研究对象,随机分为4组:(1)正常对照组:正常海马脑片培养液培养至14天。(2)痫性发作模型组:正常海马脑片培养液培养至14天,更换为含匹罗卡品(0.5mM)的完全培养液作用1h后终止培养。(3) BDNF干预组:用含BDNF的海马脑片培养液(BDNF终浓度为200ng/ml)预培养3d,换为含匹罗卡品(0.5mM)的完全培养液作用1h后终止培养。(4)抗BDNF抗体干预组:用含BDNF抗体的海马脑片培养液(BDNF抗体终浓度为5μg/ml)预培养3d,换为含匹罗卡(0.5mM)的完全培养液作用1h后终止培养。采用TUNEL原位末端标记法检测各组培养海马脑片凋亡细胞;免疫组化染色观察海马脑片神经元内BDNF蛋白的表达变化。结果: (1)痫性发作模型组:海马脑片CA1区发生凋亡的细胞(95.44±14.30)显著多于对照组(41.30±9.30)(P<0.05);BDNF蛋白表达(0.1234±0.028)较对照组(0.0642±0.023)显著升高(P<0.05)。(2) BDNF干预组:海马脑片CA1区发生凋亡的细胞(64.16±12.19)显著少于痫性发作模型组(P<0.05);BDNF蛋白表达(0.1146±0.026)较对照组显著升高(P<0.05),与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。(3)抗BDNF抗体干预组:海马脑片CA1区发生凋亡的细胞(142.78±18.81)显著多于痫性发作模型组(P<0.05);BDNF蛋白表达(0.1084±0.02675)较对照组显著升高(P<0.05),较模型组显著降低(P<0.05)。结论:(1)痫性发作可以增加体外培养海马脑片神经细胞凋亡发生,加重神经元损伤。(2)痫性发作导致培养海马脑片神经元BDNF表达增高。(3) BDNF可减轻痫性发作引起的培养海马脑片神经元凋亡的发生,对海马神经元具有抗凋亡的保护作用。第三部分BDNF对痫性发作后培养脑片神经元死亡的保护机制目的:探讨BDNF对痫性发作后培养大鼠海马脑片神经元死亡发挥保护作用的可能机制和调控因素。方法:以培养11天的海马脑片为研究对象,随机分为5组:(1)对照组:正常海马脑片培养液培养至14天。(2)痫性发作模型组:正常海马脑片培养液培养至14天,更换为含匹罗卡品(0.5mM)的完全培养液作用1h后终止培养。(3) BDNF干预组:用含BDNF的海马脑片培养液(BDNF终浓度为200ng/ml)预培养3d,换为含匹罗卡品(0.5mM)的完全培养液作用1h后终止培养。(4)抗BDNF抗体干预组:用含BDNF抗体的海马脑片培养液(BDNF抗体终浓度为5μg/ml)预培养3d,换为含匹罗卡(0.5mM)的完全培养液作用1h后终止培养。(5)抗pCREB抗体干预组:用含pCREB抗体的海马脑片培养液(pCREB抗体终浓度为5μg/ml)预培养3d,换为含匹罗卡品(0.5mM)的完全培养液作用1h后终止培养。采用TUNEL原位末端标记法检测各组凋亡细胞;免疫组化染色观察海马脑片神经元内BDNF、pCREB、NPY、Fos蛋白的表达变化。结果: (1)痫性发作模型组:海马脑片CA1区Fos蛋白表达(206.90±25.44)较对照组(83.00±19.76)显著升高(P<0.05);NPY表达(0.1086±0.027)较对照组(0.0584±0.026)显著升高(P<0.05);pCREB表达(201.36±19.31)较对照组(75.12±13.71)显著升高(P<0.05)。(2) BDNF干预组:海马脑片CA1区Fos蛋白表达(134.66±28.20)较对照组显著升高(P<0.05),较模型组显著降低(P<0.05);NPY表达(0.1350±0.028)较模型组显著升高(P<0.05);pCREB表达(184.10±21.81)较对照组显著升高(P<0.05)。(3)抗BDNF抗体干预组:海马脑片CA1区Fos蛋白表达(293.68±22.68)较对照组、模型组均显著升高(P<0.05);NPY表达(0.0942±0.024)较模型组显著降低(P<0.05);pCREB表达(192.50±17.72)较对照组显著升高(P<0.05)。(4)抗pCREB抗体干预组:海马脑片CA1区发生凋亡的细胞(140.88±18.32)较痫性发作模型组显著增多(P<0.05);BDNF蛋白表达(0.0798±0.023)较模型组显著降低(P<0.05);Fos蛋白表达(284.00±26.75)较模型组显著升高(P<0.05);NPY表达(0.0840±0.029)较模型组显著降低(P<0.05);pCREB表达(172.60±17.68)较对照组显著升高(P<0.05)。结论:(1)痫性发作后海马脑片神经细胞Fos蛋白的表达增强,BDNF可能通过抑制c-fos基因的激活水平、下调Fos蛋白的表达从而减轻海马脑片细胞凋亡的发生。(2) BDNF的增加会相应引起NPY的高表达,从而通过增加抗凋亡的保护因素来发挥抗凋亡的保护作用。(3)痫性发作后海马脑片神经细胞CREB的磷酸化增强,BDNF在癫痫发作中的高表达与pCREB的调控密切相关。