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真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物,导致动物和人类中毒。其中T-2毒素是污染范围最广,毒性最大的单端孢霉烯族真菌毒素。T-2毒素污染大麦、小麦、玉米、燕麦、谷类食品如大豆以及它们的加工产品,造成巨大的经济损失。人类或动物长期低剂量摄入T-2毒素污染的食物,可导致呕吐、拒食、胃坏死、肠道损伤、生殖障碍、免疫功能障碍和神经毒性,且幼年生长的动物比成年动物更易受到T-2毒素的影响。研究表明T-2毒素可造成奶牛、山羊、猪、鸡、鸭、虾和螃蟹等动物体重降低和生长迟缓,进而造成饲料利用率和饲料报酬率明显降低,给畜牧业带来巨大的经济损失。怀孕期间接触T-2毒素也会导致新生儿发育异常,给人类健康带来巨大影响。因此,食品和饲料中的T-2毒素污染是一个世界性问题,在人类和动物中都会造成生长受阻的健康问题,阻碍畜牧业的发展并造成严重的经济损失。尽管目前研究者发现了各种净化技术来降低饲料和农产品中T-2毒素的浓度,然而,由于这种毒素理化性质极其稳定,不可能100%降解;且T-2毒素在动物组织中累积和能穿透血脑屏障进入垂体,故找到拮抗T-2毒素所致生长障碍毒性的有效药物成为一个食品安全且亟待解决的问题。目前基于靶标筛选药物和药物表型筛选方法的结合是制药行业中发现药物的主要方法。充分的证据表明,细胞炎性反应、细胞凋亡和生长激素（GH）缺乏是T-2毒素导致动物和细胞生长迟缓的重要分子机制。实验室前期发现T-2毒素极显著提高Ras相关域家族成员4（RASSF4）的表达,且DNA甲基化调控RASSF4表达;同时他人的研究表明RASSF4与生长、细胞凋亡密切相关,但是RASSF4在T-2毒素所致的生长抑制中的作用是不清楚的;RASSF4基因启动子区甲基化的上游机制也是未知的;RASSF4启动子区的哪些转录因子能调控RASSF4,这值得探索;靶向RASSF4能否拮抗T-2毒素所致的细胞或动物生长迟缓毒性,这也是完全不清楚的。基于以上的背景和目的,本研究从细胞水平（GH3细胞）和动物水平进行探索。取得了以下结果:1.RASSF4是T-2毒素所致生长抑制毒性的关键靶点蛋白质免疫印迹（Western blot）、流式细胞法和Ed U细胞增殖分析发现,T-2毒素极显著增加促炎细胞因子和促凋亡蛋白的表达,降低抗凋亡蛋白和GH、IGF-1、IGFALS的蛋白表达,从而抑制细胞生长。荧光定量PCR（RT-q PCR）和Western blot以及间接免疫荧光法发现,T-2毒素促进RASSF4的基因和蛋白表达。超表达和si RNA干扰RASSF4的结果表明,RASSF4通过激活P38和JNK信号通路和抑制趋向生存的PI3KAkt-m TOR、ERK通路,加重T-2毒素导致的细胞炎性反应、细胞凋亡和细胞生长抑制程度;RASSF4的沉默能压制T-2毒素对这些死亡信号通路的激活,解除T-2毒素对细胞生存信号通路的抑制状态,降低T-2毒素导致的细胞炎性反应、细胞凋亡、细胞周期S期阻滞程度,从而逆转T-2毒素所致的细胞生长抑制。这充分证明RASSF4是T-2毒素所致生长阻滞的关键靶点。2.DNA去甲基化和转录因子Sp1介导T-2毒素诱导的RASSF4表达比色法的结果表明,T-2毒素暴露使基因组5-m C水平降低。甲基化特异性-q PCR进一步说明,T-2毒素降低RASSF4启动子区甲基化水平;重亚硫酸盐测序法（BSP）的结果显示,T-2毒素使Cp G岛区段的一些Cp G位点甲基化水平降低;体外甲基化酶诱导试验结合双荧光素酶基因报告系统的结果显示,RASSF4启动子区高甲基化抑制其转录活性,去甲基化激活其转录活性;此外,DNA甲基化酶抑制剂DAC或DAC联合T-2毒素更加降低RASSF4启动子区的甲基化水平,这些结果证明T-2毒素通过RASSF4启动区的去甲基化促进RASSF4表达。染色质免疫共沉淀（Ch IP）-q PCR的结果表明T-2毒素提高RASSF4基因TSSs区的H3K9ac修饰水平;组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA显著促进RASSF4的蛋白表达,这说明组蛋白乙酰化也可以促进RASSF4的表达。DAC联合TSA更显著促进RASSF4表达。这证明DNA甲基化协同组蛋白乙酰化修饰介导T-2毒素诱导的RASSF4表达。本研究也发现IL-6显著促进DNMT1/3A的表达,从而降低RASSF4表达;相反地,地塞米松Dex作为一种IL-6的清除剂,显著降低DNMT1/3A和促进RASSF4的表达,而超表达的IL-11对DNMT1和DNMT3A的表达没有影响,这表明IL-6是RASSF4发生甲基化的激发因素之一。进一步通过si RNA干扰DNMT1和DNMT3A后加T-2毒素或IL-6处理发现,仅DNMT1的沉默显著增加RASSF4的表达;且与si NC+IL-6组比,si DNMT1+IL-6增加RASSF4表达,这说明IL-6-DNMT1降低RASSF4的表达。IL-6可以显著增加RASSF4启动子区段-463～-348的甲基化水平,而DNMT1的敲低显著降低该区域的甲基化水平,这些结果表明IL-6-DNMT1通过增加RASSF4基因部分启动子区的甲基化水平,从而在一定程度降低RASSF4的表达。进一步在PROMO等数据库预测RASSF4启动子区的转录因子,选择结合位点含有Cp G位点的转录因子Sp1。构建RASSF4启动子区不同截短体的双荧光载体和Sp1的真核表达载体,然后通过双荧光素酶基因报告系统检测转录因子的核心激活区段,结果发现RASSF4启动子转录激活区位于-500～-1,且Sp1与RASSF4启动子区有4个结合位点,其中三个位于该区域。Ch IP与点突变试验证明Sp1与RASSF4启动子区的远端三个GC盒（GGGCGG）结合,且这些位点的去甲基化提高Sp1与RASSF4的结合活性。Ch IP-q PCR的结果显示T-2毒素可以促进Sp1与RASSF4启动子区结合,提高RASSF4的转录活性。进一步发现T-2毒素促进转录因子Sp1的蛋白表达,且超表达和干扰Sp1的试验发现Sp1可以正调控RASSF4的表达。有趣地,IL-6可以极显著提高Sp1的表达。这说明在T-2毒素暴露下,尽管IL-6-DNMT1可以在一定程度上降低RASSF4表达;但IL-6又可以促进Sp1的大量产生,极显著提高RASSF4表达,最终RASSF4表达增加。重要地,转录因子Sp1的沉默使T-2毒素不易诱发细胞炎性、细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而解除细胞生长抑制。3.RASSF4的抑制剂降低T-2毒素诱导的生长迟缓毒性为了筛选RASSF4蛋白的抑制剂来降低T-2毒素的生长抑制毒性,首先ITASSER网站对RASSF4的蛋白预测建模,选择打分最高的一种晶体结构模型。SYBYL-X 2.0软件对RASSF4晶体蛋白与已经准备好的小分子数据库进行分子对接,选择打分比较高的三种化合物AD-310＞AE-562＞AQ-086。CCK8的结果发现AD-310和AE-562化合物对GH3细胞毒性很低,AQ-086对GH3细胞毒性相对高,而且三种化合物能提高T-2毒素暴露下细胞的生存活力。进一步发现AD-310和AE-562能特异性抑制RASSF4的表达,且可以降低T-2毒素暴露所诱导的RASSF4。在细胞水平,仅AD-310和AE-562在一定的浓度范围内能缓解T-2毒素或LPS诱导的细胞炎性反应,降低T-2毒素所致的细胞凋亡率,逆转T-2毒素所致的细胞周期S期阻滞,从而提高GH/IGF生长轴的蛋白表达,下降T-2毒素导致的细胞生长抑制毒性。细胞热位移测定法（CETSA）和药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）试验发现,仅AD-310与RASSF4蛋白有结合潜能。氨基酸突变的结果显示,GLN136和ARG139可能是AD-310与RASSF4蛋白结合的关键位点。AE-562浓度依赖地降低Sp1的蛋白表达;双荧光素酶基因报告试验和Ch IP-q PCR表明AE-562降低Sp1在RASSF4启动子区的富集水平,这说明AE-562是在转录水平来抑制RASSF4表达。在动物水平,AD-310（6 mg/kg b.w.）减轻T-2毒素（2 mg/kg b.w.）所致的大鼠垂体损伤程度,降低T-2毒素诱导的垂体中高表达的RASSF4,减轻T-2毒素导致的大鼠垂体细胞炎性和凋亡毒性,增加T-2毒素所致垂体中低水平的GH,从而缓解T-2毒素导致的大鼠采食量低的现象和快速恢复大鼠体重。所以,RASSF4蛋白抑制剂AD-310能有效降低T-2毒素引起的生长抑制毒性。总之,本研究首先验证RASSF4靶点的重要性,然后探索T-2毒素诱导RASSF4表达的分子机制,最后靶向RASSF4寻找解毒剂降低T-2毒素引起的动物生长迟缓毒性,这将为人类健康和畜牧业的发展提供重要的策略和保障。