研究背景 不断变化的环境影响着所有生存在其中的有机体，使细胞受到来自内部和外部的各种应激和损伤。机体必须适应环境的改变才得以存活，因此需要细胞基因组做出程序性的应答，导致效应蛋白质的变化来满足细胞适应环境改变的要求。氧化应激，是由于ROS(reactiveoxygenspecies)产生和消除之间的不平衡引起的，会导致人体多种疾病和细胞损伤。不同强度的氧化应激可触发细胞内两条相反的应答途径：一条导致细胞死亡，另一条引起细胞短暂的非致死性的生理改变，后者的主要特征是适应和保护。预适应是细胞或者组织在亚致死性应激后对应激的抵抗性。热休克蛋白90(Heatshockprotein90,Hsp90)是热休克蛋白家族中的一员，在应激情况下，可以与细胞内的多种信号通路相互协调作用，与细胞损伤和保护密切相关。在氧化应激和适应中，Hsp90与应激损伤和保护关系如何，是通过何种途径发挥作用的，仍有待阐明。 目的 1.通过氧化应激和预适应建立HepG2细胞氧化应激适应模型； 2.研究在氧化应激和适应条件下，HepG2细胞活性和细胞内Hsp90表达情况； 3.建立稳定的Hsp90α下调表达和Hsp90β高表达HepG2细胞株，探讨不同Hsp90表达水平在氧化应激下对细胞活性的影响。 方法 1.建立预适应及氧化应激HepG2细胞模型：将细胞分为对照组、预适应组、氧化应激组和预适应后氧化应激组。预适应因素：50tmol/LH2O2，2h，普通培养基孵育24h，氧化应激因素：500μmol/LH2O2，24h。通过AO/EB双染色法、MTT比色法和PI染色流式细胞术观察细胞在不同条件下的存活情况。 2.稳定的Hsp90α下调表达和Hsp90β高表达HepG2细胞株的建立：进行pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β质粒的转染：经过质粒转化、提取和纯化以及琼脂糖凝胶电泳的初步筛选和测序鉴定，将重组的pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β质粒以电穿孔法转染入HepG2细胞中，经过G418筛选、传代，建立稳定的Hsp90α下调表达和Hsp90β高表达细胞株。并用蛋白质免疫印迹法(western-blotting)检测胞内Hsp90表达变化，绘制转染后细胞生长曲线。 3.应用MTT比色法测定Hsp90α下调表达和Hsp90β高表达对氧化应激处理后的细胞存活状态的影响。 4.应用western-blotting方法检测对照组和转染后的细胞在氧化应激中Hsp90的含量变化。 结果 1.AO/EB双染色结果：各组细胞经AO/EB双染色后呈现不同的染色状态：对照组细胞为正常梭形，呈均匀绿色荧光染色；预适应组可见少量绿色浓染细胞；氧化应激组可见大量绿色或红色浓染凋亡细胞；预适应后氧化应激组凋亡细胞明显少于氧化应激组。 2.MTT比色法结果：MTT比色法测定细胞生存活力比较：对照组＞预适应组＞预适应后氧化应激组＞氧化应激组(P＜0.05)。 3.PI染色流式细胞术结果：PI染色流式细胞术测细胞凋亡率比较：氧化应激组＞预适应后氧化应激组＞预适应组＞对照。(P＜0.05) 4.重组质粒的琼脂糖凝胶电泳初筛：小量提取质粒后，挑选重组质粒；DNA测序鉴定结果提示目的基因片段正确插入；转染后细胞的western-blotting的鉴定结果：转染pSmycHSP90β质粒的细胞蛋白表达条带积分光密度高，转染pSilencerHSP90α质粒的细胞蛋白表达条带积分光密度低，对照组细胞的蛋白表达条带积分光密度介于前两者之间。 5.转染pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β质粒的细胞生长曲线与对照组相比，生长情况无差别。 6.Hsp90α下调表达和Hsp90β高表达对氧化应激处理后的细胞存活状态的影响：Hsp90α下调表达组的细胞生存活力大幅度下降(P＜0.01)，Hsp90β高表达组的细胞生存活力＜预适应后氧化应激组(P＜0.01)。 7.氧化应激后细胞内Hsp90含量的western-blotting鉴定结果：各组光密度值比较：对照组＞hsp90β高表达组＞预适应组＞预适应后氧化应激组＞氧化应激组＞hsp90α下调表达组。 结论 1.不同浓度H2O2作用于HepG2细胞产生预适应和氧化应激现象，应用小剂量H2O2作用于细胞可以保护细胞免受更大浓度H2O2带来的损伤。 2.应用电转染法可以使pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β质粒在HepG2细胞中稳定表达。 3.Hsp90β主要是细胞生理情况下的构成型表达，在氧化应激条件下对细胞的保护性意义不大。 4.RNA干扰有效地降低了细胞内hsp90α的含量，Hsp90α在氧化应激中是保护细胞免受损伤的必要条件。