莱茵衣藻中响应高光的转录因子GATAX功能探究

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光合生物经常经历极端的光条件,过多的光吸收会导致光合器官发生氧化损伤。莱茵衣藻作为古老的光合生物,在生长发育过程中进化出了精细的抵御强光的机制,其中转录调控网络通过协调基因的激活或抑制来帮助细胞适应强光,维持正常生长。本研究发现了衣藻中一个响应高光的GATA家族转录因子GATAX,通过对转录组测序结果分析验证,找到了GATAX下游靶基因NY,NY类蛋白具有NYX1型锌指结构,并且在酵母细胞中参与雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin,TOR)信号通路。在真核生物中,TOR激酶可以整合多种逆境信号,参与调控蛋白质合成、细胞自噬、脂质合成以及碳氮代谢等过程,从而促进细胞的生长。与其他物种相比,目前我们对藻类中TOR信号网络的了解还很有限,尤其对其促进光合细胞生长的分子机制知之甚少。我们通过对转录因子GATAX功能的深入探究,初步得出了衣藻中GATAX通过影响NY的表达,参与调控TOR通路的结论。主要研究结果如下:(1)将低光、高光15分钟和高光30分钟处理后的野生型衣藻进行转录组测序,筛选出短时间高光处理后有明显上调的转录因子GATAX、A、B、C、D。从DNA水平、转录水平、表型三方面对突变体gatax、a、b、c-1、c-2、d进行鉴定。结果显示除了A基因的突变不影响其表达,C基因在c-2中低表达,其余基因在相应突变体中均不表达。高光表型观察显示,与野生型相比,a突变体表现为高光较敏感表型,而gatax、b、c-1、c-2、d突变体表现为高光致死表型。其中gatax除了有明显高光表型之外,在正常生长条件下还形成了Palmelloid结构,该结构的形成伴随着胞外多糖的分泌以及细胞内淀粉含量的增加。我们重点对GATAX的功能展开探究。(2)构建带GATAX自身启动子的回补载体,通过电转化的方法将重组质粒转化至gatax突变体中。待生长十天左右,挑选长势良好的20株单克隆藻株进行DNA水平、转录水平、表型的鉴定,筛选出5株转录本和表型都得到回复的转基因阳性株。(3)将野生型(gr-)、突变体(gatax)、回补株(gatax C)进行转录组测序,寻找在突变体和野生型中差异表达的,并且在回补株中得到部分或全部回复的基因。通过GO富集、KEGG富集对符合标准的2029个基因进行初步分析,发现在gatax突变体中转录本下调的基因主要涉及了蛋白质合成、核糖体生物发生以及叶绿体转运相关过程,上调的基因参与了细胞自噬以及一些代谢途径。在这些基因中,转录本差异最显著的是NY,该基因在衣藻中未被研究过。通过半定量(Semi-q PCR)和实时定量PCR(Real time-q PCR)对可能的GATAX直接或间接靶基因进行验证,验证结果与RNA-seq结果基本一致。(4)GATAX和NY有相似的表达模式,亚细胞定位观察到这两个蛋白都定位在细胞核中;通过EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)验证了转录因子GATAX结合在NY启动子GATA结合基序处;酵母双杂交实验证明了GATAX与NY蛋白之间存在相互作用,同时NY与TOR信号通路的关键元件亲免蛋白FKB12也存在互作。(5)通过对gatax突变体和NY过表达株表型精确分析,以及对RNA-seq结果验证,初步得出了GATAX通过影响NY的表达,参与调控TOR通路的结论。(6)寻找GATAX和NY在拟南芥中的同源基因,购买相应突变体,并筛选出纯合突变体atgatam、atgatan、atnym、atnyn;表型观察发现纯合单突atgatam、atgatan、atnym、atnyn与野生型生长表型没有显著差异;将拟南芥atgatam、atgatan纯合突变体进行杂交,获得了基因型为aabb的纯合双突atgatamatgatan。以上结果为研究GATAX与NY在拟南芥中同源基因的功能提供了材料基础。综上所述,本研究发现了莱茵衣藻中一个从未报道过的,能响应高光的转录因子GATAX,并且找到了该转录因子的下游靶基因NY。通过对GATAX功能的进一步探究,初步得出了GATAX通过影响NY的表达,参与调控TOR信号通路的结论。
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