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P granule 是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的“germ granule”,是一类特异于生殖系的RNP granule。已有研究表明RNA解旋酶CGH-1蛋白质和RNA结合蛋白CAR-1共定位于P granule中,并在线虫体内形成功能性复合物,参与细胞凋亡,胞质分裂,相变调控等生物学过程。阐明CGH-1蛋白质与CAR-1蛋白质的分子作用机制,对解析其生物学功能具有重要意义。在本课题研究中,CGH-1蛋白质RecA1和RecA2结构域的高分辨率晶体结构得到解析(PDB号:7DTK,7DTJ),通过结构比较发现它们与同源蛋白相应结构域的晶体结构相类似。通过分子筛色谱表明CGH-1蛋白质和CAR-1蛋白质在体外能够形成复合物,并通过生化实验验证它们的相互作用,亲和力约为3 μM,但是未能获得复合物的晶体结构。接下来,通过溶液核磁共振技术(NMR)获得CGH-1蛋白质参与识别CAR-1蛋白质的结合界面信息,鉴定出11个化学位移扰动(CSP)大于0.05的氨基酸,并结合结构比较和氨基酸突变等综合分析,结果表明CGH-1蛋白质的RecA2结构域和CAR-1蛋白质的FDF-TFG基序之间存在不连续的两处结合界面:即CAR-1蛋白质的FDF基序识别CGH-1蛋白质上的疏水口袋(由 Ala260,Val262,His269,Cys270和Leu274 组成);CAR-1 蛋白质的TFG基序与CGH-1 RecA2蛋白质之间存在静电以及疏水相互作用,从而进一步提高CAR-1蛋白质结合CGH-1蛋白质的亲和力和特异性,因为单独的CAR-1 FDF肽段结合CGH-1 RecA2结构域的亲和力约为43μM,与CAR-1 FDF-TFG基序相比,减弱约14倍。进一步研究发现,对CAR-1 FDF或CGH-1疏水口袋进行氨基酸突变分析,均使两者亲和力减弱或消除。结合序列比对和结构比对,表明这种识别机制是保守的。此外,体外实验表明CGH-1蛋白质在没有RNA或者NTL-1 aMIF4G结构域的参与下表现出较低的ATP酶活性,但在poly U RNA和NTL-1aMIF4G结构域的协同作用下,CGH-1蛋白质的ATP酶活性明显被激活。EDC3蛋白质是一个保守的mRNA脱帽增强子。已有文献报道人源DDX6蛋白质,酿酒酵母Dhh1p蛋白质(CGH-1蛋白质同源物)与EDC3蛋白质能够形成复合物,在翻译抑制和mRNA降解中发挥作用。目前还没有在线虫中关于CGH-1蛋白质与EDC3蛋白质是否能够形成功能性复合物,以及二者如何识别并发挥功能的文献报道。为了验证它们在体外确实具备相互作用的能力,通过ITC滴定实验证实CGH-1 RecA2结构域与EDC3 FDF基序之间具有相互作用(～0.34μM),并结合同源建模以及氨基酸突变分析证明EDC3 FDF基序以其特有的方式锚定于CGH-1蛋白质表面,含之前提到的部分疏水氨基酸。与CAR-1蛋白质不同的是,由于结合亲和力较高,其识别CGH-1蛋白质不需要借助其它结构域或基序的参与。以上的研究结果对于今后在线虫体内研究CGH-1蛋白质及其相互作用生物大分子的功能奠定了理论基础。