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肝硬化是威胁人类健康的常见病和多发病,而肝纤维化是肝硬化形成的共有病理改变和必经途径。因此,如何阻止或逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病、预防肝硬化的关键。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝脏合成胶原的最主要细胞;HSC活化、增殖、迁移进而合成大量的胶原等细胞外间质(extracellular matrix, ECM)成分是肝纤维化形成的中心环节。黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)在整合素介导的信号转导中发挥关键作用。研究显示,FAK磷酸化后与多种器官组织纤维化疾病有关,在肝纤维化的发生发展过程中亦发挥重要作用。我们的前期研究表明,胆总管结扎大鼠纤维化肝组织中FAK表达增强,FAK磷酸化后可以促进HSC的胶原合成,且在体外运用质粒转染方法使外源性黏着斑激酶相关非激酶(FAK related non-kinase, FRNK)在HSC过表达,可以抑制HSC的胶原合成。因此,我们推测抑制体内FAK的活化和表达可能成为逆转肝纤维化的新靶点和新方向。RNA干扰(RNA interference, RNAi)能高效特异地抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能,是目前研究基因功能和信号转导通路的最有力工具。为此,我们采用RNAi技术,在阳离子聚合物介导下将干扰质粒瞬时转染HSC,进一步研究特异性阻断FAK表达对纤维连接蛋白(fibronectin, FN)刺激的HSC胶原代谢的影响及其机制,为肝纤维化的治疗提供理论依据。目的:应用FAK shRNA质粒转染HSC,探讨特异性阻断FAK表达对FN刺激的HSCⅠ、Ⅲ型胶原表达的影响,以及该过程中MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP的表达变化。方法:应用体外细胞培养技术,在阳离子聚合物介导下瞬时转染FAK shRNA质粒,实验分为五组:①空白对照组(简写为Con);②FN刺激组(简写为FN);③转染试剂组(简写为Sofast);④阴性对照组pEGFP-HK(简写为HK组);⑤pEGFP-FAK shRNA干扰组(简称为FAK shRNA组)。②～⑤组中FN浓度均为10μg·mL-1。采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率,采用Western blot和real-time Q-PCR技术检测FAK shRNA质粒转染前后FAK与Ⅰ型胶原的蛋白和mRNA表达;real-time Q-PCR技术检测FAK shRNA质粒转染前后Ⅲ型胶原mRNA表达情况;Western blot和real-time Q-PCR技术检测MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP表达。结果:①转染后48 h,利用荧光显微镜及流式细胞术证实转染成功,转染效率约40%;Western blot分析,FAK shRNA转染后48 h,可显著下调FAK蛋白的表达,蛋白下调率为72.53%;real-time Q-PCR结果显示FAK shRNA下调FAK mRNA的表达,FAK shRNA转染HSC 24 h后下调率为76.73%;②FAK shRNA抑制Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达:real-time Q-PCR结果显示,与HK组相比,FAK shRNA组Ⅰ型胶原mRNA表达明显减少,最高下调点出现于FAKshRNA质粒转染HSC后36 h(0.69±0.03 vs 1.96±0.15),下调率为64.80%;Western blot结果显示FN组Ⅰ型胶原蛋白的合成显著高于Con组,FAK shRNA组Ⅰ型胶原蛋白表达同HK组相比显著下降,最高下调点出现于FAK shRNA质粒转染HSC后48 h(0.85±0.03 vs 2.58±0.21),下调率为67.05%;③FAK shRNA抑制Ⅲ型胶原mRNA的表达:real-time Q-PCR结果显示在转录水平上,FN组Ⅲ型胶原的合成显著高于Con组,FAK shRNA组Ⅲ型胶原的合成同HK组相比显著下降,最高下调点出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h(0.59±0.07 vs 1.62±0.12),下调率为63.58%;④FAK shRNA上调MMP-13 mRNA和蛋白的表达:real-time Q-PCR和Western blot结果显示在转录和翻译水平上,FN组MMP-13的表达显著低于Con组,而FAK shRNA组MMP-13 mRNA和蛋白的表达较HK组显著增加,最高上调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h(1.24±0.04 vs 0.79±0.03,1.74±0.20 vs 1.09±0.09),上调率分别为56.96%和59.63%;⑤FAK shRNA抑制TIMP-1 mRNA和蛋白的表达:real-time Q-PCR和Western blot结果显示在转录和翻译水平上,FN组TIMP-1的表达显著高于Con组,而FAK shRNA组TIMP-1的表达较HK组显著下降,最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h(0.49±0.02 vs 1.72±0.10,0.76±0.08 vs 2.31±0.24),下调率分别为71.51%和67.10%;⑥FAK shRNA下调TIMP-1/MMP-13比值:无论是在转录水平还是在翻译水平上,FN组TIMP-1/MMP-13比值均较Con组升高,P<0.05,但与Sofast组、HK组比较无明显差异,P>0.05,FAK shRNA组TIMP-1/MMP-13比值明显低于HK组,最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h(0.42±0.03 vs 2.19±0.17, 0.44±0.01 vs 2.11±0.05),下调率分别为80.82%和79.15%;⑦FAK shRNA上调MT1-MMP mRNA和蛋白的表达:在转录和翻译水平上,FN组MT1-MMP的表达均显著低于Con组,而FAK shRNA组MT1-MMP mRNA和蛋白的表达较HK组显著增加,最高上调点分别出现于FAK shRNA质粒转染后36 h和48 h(1.41±0.08 vs 0.85±0.04,1.72±0.10 vs 1.06±0.12),上调率分别为65.88%和62.26%;⑧FAK shRNA上调MMP-2 mRNA和蛋白的表达:在转录和翻译水平上,FN组MMP-2的表达显著低于Con组,而FAK shRNA组MMP-2 mRNA和蛋白的表达较HK组显著增加,最高上调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h(1.36±0.06 vs 0.82±0.02,1.33±0.05 vs 0.80±0.05),上调率分别为65.85%和66.25%;⑨FAK shRNA抑制TIMP-2 mRNA和蛋白的表达:在转录和翻译水平上,FN组TIMP-2的表达显著高于Con组,FAK shRNA组TIMP-2 mRNA和蛋白的表达较HK组显著下降,最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h(0.73±0.03 vs 1.54±0.04,0.53±0.08 vs 1.31±0.02),下调率分别为52.60%和59.54%;⑩FAK shRNA下调TIMP-2/MMP-2比值:无论是在转录水平还是在翻译水平上,FN组TIMP-2/MMP-2比值较Con组升高,FAK shRNA组TIMP-2/MMP-2比值显著低于HK组,最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h(0.54±0.05 vs 1.88±0.08,0.40±0.05 vs 1.64±0.13),下调率分别为71.28%和75.61%。结论:在阳离子聚合物介导下瞬时转染靶向FAK的shRNA质粒,可有效抑制FAK的表达,并可以抑制FN刺激的HSCⅠ、Ⅲ型胶原的合成,此可能与抑制FAK的表达可以下调TIMP-1和TIMP-2的表达,上调MMP-13、MT1-MMP和MMP-2的表达,从而调节TIMP-1/MMP-13和TIMP-2/MMP-2的比值有关。