帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是以黑质致密部多巴胺(Dopamine, DA)能神经元进行性变性减少为特征的神经系统疾病。虽然PD的病因仍不明确,但已发现一些与其发病相关的危险因素,如遗传,年龄及环境。由于农村居住、饮用井水或职业原因而长期接触农药被认为是一种可能的环境因素。百草枯(paraquat, PQ),一种广泛使用的除草剂,由于其与1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)活性代谢产物MPP+(1-methyl-4-phenyl pyridinium cation)结构的相似性,日益引起人们的浓厚兴趣。MPTP是一种人工合成的神经毒性物质,能使动物和人出现PD症状。因此,PQ与MPP+结构的相似性提示我们PQ可能是PD发病的环境因素之一。流行病学研究显示农业中PQ的使用与PD的发病率具有相关性。而且,已有资料报道PQ可选择性损伤DA能神经元并导致动物神经行为学症状的出现。绿茶,由于其对癌症、心血管疾病、炎性疾病及神经退行性疾病等多种疾病的有益作用而越来越受到人们的喜爱。近年来,绿茶的神经保护作用逐渐成为人们关注的焦点。研究显示长期坚持每天饮用两杯或两杯以上的绿茶与PD患病率的下降有关。在PD的细胞模型中也证实了绿茶提取物的神经保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯((?)-epigallocatechin-3-gallate, EGCG),绿茶多酚的主要成分,绿茶提取物的生物活性主要是由EGCG来发挥的。已有实验证实EGCG可以减轻由神经毒性物质、缺血、缺氧及血清撤除等因素造成的神经细胞损伤。研究发现在小鼠模型中,EGCG可抑制MPTP诱导的DA能神经元变性。继之其后,有报道认为抑制黑质中神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)的产生是EGCG对MPTP毒性阻断作用的可能机制之一。然而,EGCG对PQ诱导的DA能神经元的损伤是否具有保护作用,目前尚未见报道。本研究选择具有DA能神经元特性的PC12细胞建立体外模型,旨在观察EGCG对PQ诱导的DA能神经元损伤是否具有保护作用,并从细胞凋亡角度对EGCG的作用机制做初步探讨。实验内容如下:实验一目的:筛选出PQ诱导PC12细胞损伤的有效浓度、时间及EGCG对该浓度PQ损伤PC12细胞的有效保护浓度。方法:PQ损伤作用:设空白对照组及200、400、600、800、1000μmol/L五个PQ浓度组,各浓度设12、24、36、48h四个干预时间。EGCG保护作用:设空白对照组、PQ损伤组(800μmol/L)、不同浓度的EGCG(1、5、10、50、100、200μmol/L)保护组,采用MTT比色法对各浓度进行筛选。结果:经MTT比色法检测,PQ对PC12细胞具有损伤作用,其诱导的细胞活力的降低具有剂量和时间依赖性。与对照组相比,800μmol/L PQ处理24h后细胞活力为53±3.2% (P<0.001)。而PC12细胞经不同浓度的EGCG预处理2h后,再经800μmol/L的PQ处理24h,我们发现1、5、10μmol/L EGCG预处理组与PQ组(54.6±3.5%)相比,可减少细胞死亡,细胞活力分别上升为66.5±2.7% (P>0.05)、74.4±2.6% (P<0.05)、83.7±3.2% (P<0.01),但高浓度的EGCG (50、100、200μmol/L)则没有保护作用。结论:PQ对PC12细胞具有损伤作用,且其损伤作用具有剂量和时间依赖性;EGCG的生物活性具有浓度依赖性的双相调节模式:低浓度的EGCG对PQ所诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,而高浓度的EGCG则没有保护作用。实验二目的:探讨EGCG对PQ诱导PC12细胞凋亡的保护作用。方法:MTT比色试验检测细胞活性;Hoechst染色观察细胞核形态的改变;TUNEL染色观察细胞DNA的断裂情况;FCM检测细胞凋亡比例。结果:MTT法检测显示,1、5、10μmol/L EGCG可抑制800μmol/L PQ作用24h所诱导的PC12细胞活性的降低,与PQ组(54.6±3.5%)相比,EGCG预处理后细胞活力分别上升为66.5±2.7% (P>0.05)、74.4±2.6% (P<0.05)、83.7±3.2% (P<0.01);正常细胞核经Hoechst染色后显示为较大的圆形,形态规则,染色均匀弥散。经PQ处理24h后,多数细胞显示胞核凝集,呈现不均匀的亮蓝色荧光。与PQ组相比(43.5±8.4%),1、5、10μmol/L EGCG预处理可减少胞核凝集,分别下降至30.7±7.9% (P<0.05)、17.9±6.8% (P<0.001)、11.2±4.4% (P<0.001);TUNEL染色显示,PQ组(32.4±6.7%)与对照组(5.2±1.9%)相比,TUNEL阳性细胞增加(P<0.001)。而经EGCG预处理后,与PQ组相比,TUNEL阳性细胞的数量明显减少至25.9±7.7% (P>0.05)、16.6±3.2% (P<0.01)、9.6±3.2% (P<0.001);FCM结果显示,PQ处理后,凋亡细胞的比例(39.9%)与对照组(4%)相比是增加的,而经1、5、10μmol/L EGCG预处理后,凋亡细胞比例分别降至32.6%,20.1%,10.4%。结论:EGCG可抑制PQ诱导的PC12细胞凋亡。实验三目的:探讨EGCG对PQ诱导PC12细胞凋亡保护作用的相关机制。方法:Rhodamine123染色检测MMP;Caspase-3活性检测;免疫细胞化学染色及Western blotting方法检测凋亡相关蛋白(Cyto C、Smac)表达。结果:Rhodamine123染色显示,800μmol/L PQ处理24h后,细胞的荧光强度与对照相比显著降低(P<0.001)。而EGCG可剂量依赖性的减轻MMP的下降。与PQ组(26.2±2.8%)相比,经1、5、10μmol/L EGCG预处理后,细胞荧光强度分别增至41.3±3.6%(P<0.01),56.7±5.4%(P<0.001),82.9±4.2%(P<0.001);PQ组与正常对照组相比,Caspase-3活性显著增强(P<0.001),而这种激活可被1、5、10μmol/L EGCG预处理所抑制。与PQ组(216.5±9.6)相比,经EGCG预处理后,Caspase-3活性分别降至179.9±7.6(P<0.001)、123.2±8.1 (P<0.001)、68.5±6.1(P<0.001);免疫细胞化学染色显示正常组细胞形态良好,Cyto C、Smac染色呈淡棕黄色,均匀分布于胞质及突起内。PQ处理后部分细胞变圆,皱缩,Cyto C、Smac在细胞内表达增强,染色呈深棕黄色。相对于PQ组,EGCG预处理组的Cyto C、Smac免疫细胞化学染色明显减弱,细胞形态也有改善。Western blotting检测Smac蛋白表达结果表明PQ处理后胞浆内Smac表达增加,EGCG预处理可以抑制这种改变。结论:EGCG对PQ诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用,机制可能与其维持细胞MMP、抑制Caspase-3激活、调节凋亡相关蛋白Cyto C及Smac在胞浆中的表达有关。