基于核酸的PCR诊断,相比基于酶或抗体的分析方法,具有更高的修改灵活性、检测灵敏度以及可以更快、更早地获得检测结果等优势,是流行病控制、农业病害防治、食品安全及法医鉴定等领域的重要研究工具。然而,PCR诊断现局限于实验室内使用,繁琐、耗时的核酸提取过程是制约PCR诊断整体通量和效率的关键瓶颈,并对PCR诊断的准确性有着决定性的影响。相比液相核酸分离,固相核酸分离具有污染试剂少、操作更简单、通量更高、可自动化等优势,尤其磁力分离,依赖磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles,MNPs）的核酸结合能力和超顺磁性,不再需要繁琐离心操作和辅助电子设备,成为目前主流的高通量、可自动化核酸固相提取技术。尽管磁力分离相对快速（一般小于15min）且具有非常多的市场化商品,但仍然不能满足PCR诊断实验室之外的大规模流行病学调查的使用需求。从复杂的生物体样本中提取核酸的全过程,涉及生物样本裂解和核酸分离纯化两个关键步骤。生物样本裂解过程现存在蒸汽污染重、时间长、繁琐耗时、PCR抑制剂残留等弊端,严重制约着核酸提取整体通量、效率及下游PCR诊断的准确性。而磁力分离过程机制尚缺少相关研究基础,MNPs的聚集、沉降效应、表面不同功能化等对核酸分离过程的影响尚不甚明晰,是导致磁力分离不能实现高效应用的重要原因。而非磁力固相载体从混合液体系中分离,仍然需要依赖多步离心或反复移液等繁琐操作,导致劳动密集、通量低,是制约非磁力分离的关键瓶颈。因此,为了推动PCR诊断走出实验室,实现全过程高通量、可自动化的病原筛查应用,针对上述核酸提取方法中面临的几大问题,本文提出高通量核酸固相提取过程机理及病原PCR诊断应用研究,内容及结果如下。（1）高效生物样本裂解过程研究。为了解决繁琐耗时的生物样本裂解过程对核酸提取过程的整体通量和时效性的制约,本文以廉价、无毒的碱溶液,作为高效细胞裂解剂,建立了室温裂解过程;并结合磁力分离过程,建立可全程在96孔板上操作的高通量核酸磁力提取方法（简称ALMS提取）;继而将该方法应用于柞蚕组织样本和干血斑样本的基因组DNA提取,并对其时效性、提取质量及抗干扰性能进行了评估。实验结果表明,碱溶液裂解剂能快速、高效裂解样本（最短5 min）;ALMS提取,快速、通量高,最短20 min可完成96个样本的平行提取;其抗干扰性能好,能有效避免柞蚕组织样本提取过程中PCR抑制剂的干扰和残留,核酸提取品质高;全过程室温操作,蒸汽污染风险低,应用于病原PCR诊断,诊断准确度和灵敏度高。综上,高效碱液裂解过程有效提升了磁力核酸提取过程的整体效率、全过程通量及核酸提取质量,更能满足全过程高通量、可自动化PCR诊断的需求,为进一步优化、建立高效PCR诊断的核酸模板制备过程提供依据。（2）磁力分离过程动力学机制研究。为了强化磁力分离应用效率,揭示其核酸分离动力学机制,本文制备了4个不同粒径的、不同官能团（羟基、氨基及羧基）表面负载的磁性纳米颗粒（简称MNPs-OH,MNPs-NH2和MNPs-COOH）,通过分子动力学模拟（Molecular dynamics,MD）预测了三种MNPs与核酸及典型杂质的亲和性,并系统考察了它们在动物组织样本的核酸提取过程中的综合分离性能。MD模拟结果显示,MNPs-NH2对核酸分子具有最高的亲和性能;在大多数分离体系的实验中,三种MNPs提取核酸的产率呈现MNPs-NH2＞MNPs-OH＞MNPs-COOH规律,与MD模拟结果一致;不同粒径的MNPs具有明显不同的沉降和分散特性,从而分离效果不同;新提出了一种高通量、低蒸汽污染风险的、优化的室温核酸分离方法,为PCR诊断应用中大规模同时提取核酸提供了一条可行途径。这项工作为先进的MNPs制备策略和复杂生物样品中的核酸强化分离过程提供了理论指导。（3）高通量非磁力核酸快速分离过程研究。为了解决非磁力固相分离过程缺少快捷分离驱动力的瓶颈问题,本文提出利用3D打印技术的精准制造优势,以具有核酸结合能力的3D打印基材聚丙烯酸（PAA）为原材料,构建了一体化的、具有多元界面微结构的梳状核酸分离器,并进行了结构、元素及稳定性的表征和核酸提取过程、性能的评估和分离机理的讨论。实验结果显示,3D打印PAA分离器的螺旋和凹槽微结构具有理想的打印精度和结构稳定性,可重复使用,核酸分离性能良好。分离器的界面杂化微结构,增强了核酸结合的比表面积,且表面富集的羧基官能团强化了相界面亲和性,有利于提高了核酸的提取性能,在优化的分离条件下,可以达到与市售磁力分离试剂盒相当的提取产率。建立的基于3D打印PAA分离器的核酸分离方法（简称3D-PAA方法）具有分离时间短（最短1 min）、无需额外设备（无磁力要求）、无需大量劳动（无移液和离心）等优点。核酸扩增结果表明,分离得到的核酸可以满足进一步PCR扩增的要求,有望应用于高通量的PCR诊断领域。（4）全过程高通量、可自动化病原PCR诊断应用。将高效裂解过程促进的磁力核酸提取技术（ALMS提取）,及新建立的3D-PAA方法应用于微孢子虫和疟原虫的PCR诊断（简称ALMS-q PCR和3D-PAA方法）,并对大规模病原筛查的灵敏度及稳定性进行了评估。结果表明,ALMS-q PCR比常规方法具有更高的检测灵敏度,在柞蚕微粒子病筛查对照实验中,ALMS-q PCR的病原检出率比镜检高出10.8倍,在低病原流行组中,其检测灵敏度优势更显著;应用于柞蚕业微粒子病控制,不仅能有效提前检测时期,同时能同步筛查野外交叉感染,能更彻底、有效地发现感染、阻断传播。对于疟原虫的检测,ALMS-q PCR的检出率显著高于常规巢式PCR,并省去了巢式PCR诊断中繁琐耗时的凝胶电泳。实验证明了3D-PAA方法能有效实现微孢子虫的q PCR诊断和疟原虫的巢式PCR诊断,依托其快速、方便、高通量的优点,有望用于大规模的病原体PCR诊断和流行病学调查研究。综上所述,本文通过强化的生物样本裂解过程有效提升了磁力核酸提取,并初步揭示了磁力核酸分离过程的动力学机理;新建了一种基于3D打印集成分离器的高通量核酸非磁力分离方法;证明了强化的磁力提取技术和新建的非磁力提取技术在病原PCR诊断中的可行性、稳定性及高灵敏度病原检测优势。该研究解决了PCR诊断模板制备中存在的问题,对促进诊断PCR走出实验室实现临床/生产实际应用具有重要意义。先进的诊断PCR技术在食品安全、法医检测、流行病检测、农渔业病害控制等领域具有广阔的应用前景。