目的:膀胱肿瘤是世界范围内最常见的肿瘤之一,高达70%的膀胱肿瘤患者最初诊断为非浸润性膀胱肿瘤,其中超过70%的患者可能在未来复发,甚至复发多次。虽然,目前膀胱肿瘤患者的术后5年生存率较高,但是其复发率极高,加重了患者精神以及经济负担。因此,急需找到膀胱肿瘤复发以及预后不良的原因。肿瘤干细胞(CSCs)已被证明是多种癌症进展和预后不良的一个重要因素。其作用机制及生物学功能的研究,近来越来越多地被发掘和研究。在膀胱肿瘤中,肿瘤干细胞的相关研究近年来越来越多,但完整的从肿瘤干细胞筛选到转录组分析,差异关键因子的筛选以及自上而下的深入调控通路在膀胱肿瘤研究中罕有详细的报道。因此,在本研究中,我们通过筛选培养并鉴定了膀胱肿瘤干细胞(BCSCs),随后通过转录组芯片分析发现了肿瘤干细胞与其亲代膀胱肿瘤细胞之间关键的差异表达基因(DEGs)。以此作为研究基础,筛选出了关键的差异因子,通过探索关键因子在膀胱肿瘤中的生物学特性,以及其主要影响的蛋白信号通路,探索其在膀胱肿瘤中的发挥作用的详细生物学机制,为提示膀胱肿瘤进展和预后不良提供更加充分的理论基础。研究方法:1.膀胱肿瘤干细胞的构建,培养及鉴定选取2株稳定膀胱肿瘤细胞系作为亲代细胞系,通过无血清培养基筛选法构建并培养其对应的膀胱肿瘤干细胞。为了验证肿瘤干细胞是否培养有效,待肿瘤干细胞成球稳定,即传代至第三代时,提取总RNA,利用PCR技术检测肿瘤干细胞经典蛋白的mRNA表达水平。通过动物实验验证肿瘤干细胞成瘤能力与其对应亲代细胞系成瘤能力的差异。2.差异基因的筛选通过使用Affymetrix HTA 2.0 Array进行肿瘤干细胞及其对应亲代细胞系的转录组分析。通过GCBI网络分析实验室平台(http://www.gcbi.com.cn)进行分组和差异基因分析。将2株不同来源的肿瘤干细胞及其亲代细胞系的差异基因进行交集处理,筛选出不同细胞系来源的共同差异基因作为候选差异基因。3.差异表达基因与膀胱肿瘤的预后相关性分析通过TCGA(GEPIA分析平台)、ONCOMINE等网上公共数据库,查询候选差异基因在膀胱肿瘤以及正常膀胱组织中表达情况,以及对膀胱肿瘤生存率的影响。选取其中表达差异最明显,且对膀胱肿瘤生存率具有较大影响的因子作为研究对象。从标本库中随机抽取病理诊断明确的膀胱肿瘤病例,提取癌组织和正常组织的总RNA和总蛋白,分别利用PCR技术和Western blot技术检测上述筛选出的因子的表达情况。培养多种膀胱肿瘤细胞系,分别提取总RNA和总蛋白,分别利用PCR技术和Western blot技术检测上述筛选出的因子的表达情况。4.关键因子在膀胱肿瘤细胞系中的功能实验使用小RNA干扰技术以及小分子抑制剂的添加,处理膀胱肿瘤细胞系,利用CCK-8增殖实验,EdU增殖能力检测,克隆形成实验,细胞周期检测,细胞成球实验以及实时细胞增殖能力检测仪器等检测手段进行细胞增殖能力的检测。利用流式细胞仪技术,通过检测使用小RNA干扰技术以及小分子抑制剂的添加处理的细胞的FITC标记的Annexin V和Propidium Iodide,统计凋亡细胞比例,判断干预因素对肿瘤细胞凋亡能力的影响。利用Transwell小室,通过检测使用小RNA干扰技术以及小分子抑制剂的添加处理的细胞,进行细胞迁移侵袭能力的检测。5.关键因子干预后,膀胱肿瘤细胞系的转录组,脂代谢组改变使用小分子抑制剂处理膀胱肿瘤细胞系,将此实验组和对照组进行转录组学和脂代谢组学测序检测。分析转录组差异蛋白通路以及差异脂肪酸。进行裸鼠皮下成瘤实验,在4-6周Balb/c裸鼠皮下,注射膀胱肿瘤细胞,待形成50mm~3左右的瘤体时,使用小分子抑制剂和差异脂肪酸进行灌胃处理,1天2次,观察移植瘤模型的生长情况喂养3周后,处死。观察不同组别肿瘤大小重量。结果:1.通过选取2株稳定膀胱肿瘤细胞系作为亲代细胞系,通过无血清培养基筛选法成功构建并培养出其对应的膀胱肿瘤干细胞。将肿瘤干细胞传代至第三代时,提取总RNA,利用PCR技术检测,经筛选培养后的肿瘤干细胞样品中肿瘤干细胞经典蛋白的mRNA表达水平明显高于其对应亲代细胞系中的肿瘤干细胞经典蛋白。通过动物实验发现,肿瘤干细胞成瘤能力明显强于其对应亲代细胞系成瘤能力。2.通过转录组分析和差异表达基因分析,得到共17个差异表达基因,分别是ABCB1、SLC14A1、IL24、IFI44、DDX60、CXCL11、CLEC2B、SCD、RDH10、SLITRK6、PI3、IL7R、PAG1、DHRS3、C3、CDH2、IL8。3.通过TCGA(GEPIA分析平台)、ONCOMINE等网上公共数据库查询发现,17个候选差异基因中,只有SCD在膀胱肿瘤和膀胱正常组织中表达差异明显,同时对膀胱肿瘤患者预后具有不良影响。4.通过细胞功能实验发现,使用小RNA干扰技术以及小分子抑制剂处理膀胱肿瘤细胞后,能够明显抑制肿瘤细胞的增殖能力,一定程度上抑制膀胱肿瘤细胞的侵袭迁移能力,膀胱肿瘤并不因为SCD因子的抑制而出现凋亡。5.使用小分子抑制剂处理膀胱肿瘤细胞系,将此实验组和对照组进行转录组学和脂代谢组学测序检测。分析发现,SCD抑制剂主要影响的通路为Cell cycle、DNA replication、Cytokine-cytokine receptor interaction、TNF signaling pathway、Fanconi anemia pathway、Homologous recombination、Bladder cancer、p53 signaling pathway。游离脂肪酸中,神经酸含量出现了明显下降。通过在动物模型中,使用SCD小分子抑制剂和神经酸灌胃处理,发现SCD小分子抑制剂组相比空白对照组,肿瘤重量有下降趋势,神经酸灌胃处理组成瘤能力明显优于小分子抑制剂灌胃组。结论:SCD是膀胱肿瘤干细胞的重要标志物,其高表达与膀胱肿瘤的进展以及不良预后有着重要相关性。SCD活性的下调能够通过调控细胞周期相关蛋白,引起细胞周期组织,有效抑制膀胱肿瘤细胞的增殖能力,除此之外,细胞膜功能相关的通路也出现部分抑制。SCD活性的抑制,使细胞单不饱和脂肪酸合成出现不同程度的减少,其中神经酸含量出现明显下降,动物实验证明神经酸能够明显促进肿瘤生长。