背景和目的:骨关节炎（OA）是最常见的退行性关节疾病,其主要表现为:软骨基质破坏、软骨下骨重塑和滑膜炎症。目前临床上并没有有效的治疗方法,直到最后阶段由于疾病需要而进行关节置换手术。骨关节炎的发生主要归因于关节软骨合成代谢和分解代谢的失衡,而促炎症因子（如IL-1β、TNF-α和IL-6）在这个过程中扮演至关重要的角色。其中,IL-1β主要参与软骨基质降解,而TNF-α则主要介导OA中炎症级联反应。因此,干预TNF-α介导的信号通路可能是一个更加有效的治疗骨关节炎的手段,然而,目前对TNF-α介导的信号通路的负性调节知之甚少。Micro RNA是一类长度为19-24个核苷酸的非编码小RNA,主要通过介导m RNA的降解或抑制其翻译来发挥对基因的转录后调控作用。近年来的研究已经确定了几个和骨关节炎相关的miRNA:miR-140、miR-27b、miR-125b、miR-146a和miR-30a。然而上述miRNA均仅仅靶向于几种基质蛋白水解酶（MMPs和ADAMTS）中的一种,因此它们在治疗软骨降解中的有效性有待商榷。由于TNF-α介导炎症级联放大反应,因此靶向于TNF-α信号通路中信号分子的miRNA可能会更加广泛地影响基质蛋白水解酶的产生,从而能够更加有效地缓解骨关节炎引起的软骨退变。本课题拟筛选参与调控TNF-α下游信号通路的miRNA,并探讨其在TNF-α介导的信号通路及软骨基质降解中的作用及分子机制。内容和方法:利用miRNA表达谱芯片和实时荧光定量PCR筛选经TNF-α处理的大鼠原代软骨细胞中差异表达的miRNA。实时荧光定量PCR检测正常人和骨关节炎病人的关节软骨中miR-145的表达水平。染色质免疫共沉淀检测p65和编码miR-145基因的启动子区的结合情况。将miR-145的模拟物或抑制剂分别转染进原代软骨细胞,实时荧光定量PCR和蛋白印迹分析TNF-α诱导的基质蛋白水解酶（MMP-3、MMP-13和Adamts-5）的表达水平。生物信息学方法预测miR-145的靶基因,并利用荧光素酶报告载体实验验证miR-145和MKK4 3’UTR区的结合。蛋白印迹分析过表达或敲减miR-145对TNF-α下游NF-κB和MAPK信号通路激活的影响。染色质免疫共沉淀分析转录因子c-Jun和ATF2与编码基质蛋白水解酶（MMP-3、MMP-13和Adamts-5）基因的启动子区的结合。用含有MKK4小发夹RNA（MKK4 sh RNA）或MKK4蛋白编码区（CDS）的慢病毒分别感染原代软骨细胞,实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测TNF-α诱导的基质蛋白水解酶的表达。免疫组化检测骨关节炎大鼠关节软骨组织中MKK4和p-MKK4的水平。构建半月板不稳定（DMM）大鼠OA模型,关节腔分别注射miR-145长效激动剂（agomir-145）、含有MKK4 sh RNA的慢病毒（Len-sh MKK4）、JNK通路抑制剂（SP600125）、p38通路抑制剂（SB203508）及TNF-α分泌抑制剂（CC-5013）,番红快绿染色分析关节软骨降解情况,免疫组化检测关节软骨组织中p-MKK4、p-c-Jun、p-ATF2、MMP-3及MMP-13的水平。结果:TNF-α显著抑制软骨细胞中miR-145的表达,并且miR-145的表达水平与骨关节炎发生过程中TNF-α的分泌呈负相关关系。过表达miR-145则反过来广泛地抑制TNF-α诱导的几种基质蛋白水解酶（MMP-3、MMP-13和Adamts-5）的产生。机制研究表明,miR-145通过抑制MKK4的翻译过程从而抑制MKK4的磷酸化,进而抑制JNK和p38的活化以及p-c-Jun和p-ATF2的入核,最终抑制编码基质蛋白水解酶基因的转录。p-ATF2可以结合Mmp-13的启动子区域,而p-c-Jun则可以结合Mmp-3和Adamts-5的启动子区。敲低MKK4可以显著抑制TNF-α诱导的基质蛋白水解酶的产生以及JNK和p38的活化,同时有效地缓解了手术诱导的骨关节炎引起的软骨降解。相反,抑制miR-145或者过表达MKK4则加剧了基质蛋白水解酶的产生以及软骨的破坏。关节腔注射agomir-145、Len-sh MKK4、SP600125、SB203508或CC-5013均可以有效地缓解骨关节炎大鼠软骨退变。结论:我们的研究表明miR-145通过靶向于MKK4来负调控骨关节炎中TNF-α介导的炎症信号通路及软骨基质降解,且该过程是通过抑制JNK/p38-c-Jun/ATF2轴来实现的。因此,miR-145和MKK4可以作为治疗骨关节炎引起的软骨降解的有效靶点。