目的:破骨细胞介导的骨吸收功能参与骨代谢动态平衡过程,破骨细胞数量过多或功能过度活跃导致多种骨疾病发生,如类风湿性关节炎、骨质疏松症等。破骨细胞分化过程中细胞内ROS水平升高,NF-κB和MAPK等炎症信号通路被激活。MAT2A是将甲硫氨酸和三磷酸腺苷转化为SAM的关键酶,由此调节细胞甲基化修饰。它也参与NF-κB通路活化和ROS的平衡过程,MAT2A是否影响破骨细胞的分化及机制尚未有相关报道。本课题旨在研究MAT2A对破骨细胞的作用和调控分子机制,为治疗骨质疏松症等破骨细胞相关骨疾病提供潜在的干预靶点和新的治疗策略。方法:1.利用免疫印迹法、免疫荧光成像对破骨细胞形成过程中MAT2A表达水平进行定量分析。使用MAT2A特异性小分子抑制剂AG-270干预BMMs以验证对其增殖能力的影响。2.使用AG-270和靶向小鼠MAT2A基因的sh RNA慢病毒以抑制MAT2A活性,通过TRAP染色、F-Actin染色和骨板吸收实验验证其对破骨细胞形成和功能的影响。实时定量PCR和免疫印迹法对参与破骨分化过程中的关键转录因子以及破骨细胞标记基因进行定量分析,检测细胞ROS水平,通过免疫印迹法对Nrf2通路相关蛋白进行定量分析,并检测NF-κB以及MAPK通路激活情况。3.构建小鼠卵巢切除模型,以模拟绝经后骨质疏松症的发生。待模型成功后,按照分组设计,每日灌胃给予溶剂或不同浓度的AG-270,持续6周。分离小鼠股骨,加入固定液静置3天,micro-CT扫描并进行数据分析,评价小鼠股骨远端松质骨情况,组织切片TRAP染色和形态学分析以评价股骨组织内破骨细胞分化情况。4.类靶向代谢组学分析RANKL干预下破骨前体细胞代谢变化,分析MAT2A相关代谢物变化从而找出潜在分子机制。抑制MAT2A并添加SAM,检测其对破骨形成和功能的影响。通过实时定量PCR和免疫印迹法检测破骨细胞分化相关重要基因的表达,检测细胞ROS水平,免疫印迹法分析Nrf2通路相关蛋白表达水平、NF-κB和MAPK通路激活水平。结果:1.破骨前体细胞和成熟破骨细胞中MAT2A含量均升高,证明MAT2A参与破骨分化。其特异性抑制剂AG-270对BMMs和小鼠均无毒副作用。2.AG-270和靶向MAT2A的sh RNA慢病毒均可以显著抑制破骨细胞形成的数量和体积,抑制其骨吸收能力,降低破骨分化过程中重要基因的表达水平,证明MAT2A对破骨细胞发育具有重要作用。3.通过灌胃给予AG-270可以减缓卵巢切除小鼠的骨量下降,骨组织内破骨细胞被明显抑制,表明AG-270在动物体内也可以抑制破骨细胞形成。4.抑制MAT2A明显降低细胞ROS水平并增强Nrf2通路蛋白表达,抑制NF-κB和MAPK通路中关键蛋白磷酸化水平。这表明抑制MAT2A活性可以抑制细胞内ROS水平,降低NF-κB和MAPK信号通路活性。5.RANKL干预下,破骨前体细胞代谢活跃,MAT2A相关代谢物含量增加,抑制MAT2A可以降低SAM等代谢物含量,通过添加SAM可以部分挽救抑制MAT2A对细胞内ROS水平,NF-κB和MAPK通路活性的负向调节作用,说明MAT2A通过SAM影响下游通路进而参与破骨分化过程这一潜在分子机制。结论:抑制MAT2A可以阻碍破骨细胞分化并减弱其骨吸收功能,降低细胞内MAT2A相关代谢物含量,进而减少细胞内ROS生成,减弱NF-κB和MAPK通路活性。MAT2A特异性抑制剂AG-270可以减缓卵巢切除小鼠的骨量下降。总之,这些发现表明,MAT2A对破骨细胞分化和功能至关重要,可能成为治疗破骨细胞过度活跃所致骨质疏松症等相关骨疾病的潜在治疗靶点。