论文部分内容阅读
芍药甙(paeoniflorin，PF)属于单萜糖甙，为白芍总甙(total glucosides ofpaeonia，TGP)中主要的药物活性成分。白芍总甙具有抗炎和免疫调节等药理作用，临床上用于类风湿性关节炎及老年病的治疗，效果较好。最近有研究发现，PF在动物脑缺血[1-3]和帕金森[4]模型中具有神经保护作用。但目前尚未见有关PF对多发性硬化(multiple sclerosis，MS)模型实验性自身免疫脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的治疗作用的报道。本研究利用小鼠EAE模型，观察PF的神经保护作用并探讨其可能的作用机制。第一部分芍药甙在MOG EAE小鼠模型中的神经保护作用目的：建立MOG35-55诱导的EAE小鼠模型；观察PF对EAE模型的保护作用。方法：使用人工合成的MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 35-55在百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)和完全福氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)辅助下免疫雌性C57BL／6N小鼠制作EAE模型，观察模型的行为学变化(体重和临床评分)和组织学变化(脊髓苏木素-伊红染色、髓鞘染色和轴索染色)；在围免疫期(MOG免疫前、后各7天)每天给模型皮下注射2.5mg／kg和5mg／kg，观察PF对EAE模型是否具有保护作用。结果：1．行为学改变：免疫后第二天起小鼠体重出现明显下降，但在随后的一周时间内呈逐渐恢复趋势，免疫后12天左右，伴随着体重的再次下降，小鼠出现运动功能障碍，评分开始上升，发病后表现为慢性进展型，近六周时间内，小鼠体重总体趋势向上，临床症状加重时，体重也随之波动出现小幅下降。2．形态学改变：脊髓HE染色显示，脊髓内出现血管“袖套样”改变，小血管尤其是小静脉周围有大量炎性细胞密集环绕而成，呈“袖套样”。髓鞘染色可见大小不等的片状脱髓鞘区，白质中的蓝色髓鞘区域减少呈空泡样变。银染提示脊髓轴索损伤减少。3．PF对模型的保护作用：免疫后的15天内模型组、2.5mg／kg和5mg／kg PF组模型之间的病情严重程度没有明显区别，免疫15天后，2.5mg／kg PF组模型的行为学和形态学改变与模型组相比没有达到统计学显著差异，而5mg／kg PF组模型的行为学和形态学改变相对于模型组达到了具有统计学显著差异的改善。第二部分芍药甙对MOG EAE小鼠模型中神经炎性反应的抑制作用目的：研究5mg／kg的PF对MOG EAE小鼠模型中神经炎性反应的影响。方法：观察MOG EAE小鼠模型的细胞免疫学变化(淋巴细胞增殖试验、CD4+CD25+调节性T细胞及淋巴细胞NO合成量)、细胞因子mRNA表达(INF-γ、IL-1β、iNOS及IL-10)和IκBα的影响。结果：1．细胞免疫学：PF可以抑制EAE模型淋巴细胞对MOG35-55的特异性反应，具有一定的免疫抑制作用；PF对EAE模型的CD4+CD25+调节性T细胞具有上调作用；PF可以抑制EAE模型淋巴细胞NO的生成。2．细胞因子mRNA表达：PF抑制EAE模型致炎性细胞因子INF-γ、IL-1β及iNOS的表达并增加抑制性细胞因子IL-10的表达。3．PF能够抑制EAE模型IκBα的降解，间接说明PF能抑制NF-κB的活化。第三部分芍药甙通过A1AR发挥抑制神经炎性反应和神经保护作用目的：研究A1AR是否参与了PF对MOG EAE小鼠模型的保护作用。方法：每次PF注射之前15min腹腔注射A1AR的特异性拮抗剂DPCPX(1，3-Dipropyl-8-cyclopentylxanthine) 0.3mg／kg，．观察DPCPX是否能阻断PF对MOG EAE小鼠模型的保护作用，包括行为学、形态学、细胞免疫学、细胞因子mRNA表达及IκBα的影响。结果：在PF注射之前15min皮下注射0.3mg／kg的DPCPX可以阻断5mg／kg的PF对MOG EAE小鼠模型行为学、形态学、细胞免疫学、细胞因子mRNA表达及IκBα的改善作用。结论1．用MOG35-55成功地制作了小鼠EAE模型；2．PF在MOG EAE小鼠模型中能够缓解炎性脱髓鞘过程，改善临床症状；3．PF在MOG EAE小鼠模型中能够缓解脊髓内神经炎性反应，包括下调致炎性细胞因子和上调抑制性细胞因子、减低MOG35-55特异性淋巴细胞增殖反应、上调CD4+CD25+调节性T细胞、抑制NF-κB的活化、下调iNOS表达和NO合成；4．PF通过激动A1AR而抑制神经炎性反应和发挥神经保护作用。