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飞蝗是重要的农业害虫,生殖能力强、产卵量大是蝗灾得以暴发的重要原因。飞蝗生殖包括卵黄生成(vitellogenesis)和卵母细胞成熟(oocyte maturation),主要由保幼激素(Juvenile hormone,JH)调控,JH促进脂肪体中卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)的合成,大量合成的卵黄原蛋白通过血淋巴运输到卵巢,通过卵泡上皮细胞之间的通道运输到发育中的卵细胞。前期在飞蝗中的研究表明,JH通过受体复合体Met/Taiman调控其早期响应基因Krüppel-homolog 1(Kr-h1)的转录,促进飞蝗卵黄生成。所以,Kr-h1是飞蝗卵黄生成中的关键基因。microRNA(miRNA)是一种长度约为23个核苷酸的非编码单链RNA分子,在昆虫生殖、发育和变态中发挥重要作用。miRNA分子的一条链可与Argonaute(Ago)结合,形成RNA介导的沉默复合物(RISC),引起靶基因的翻译抑制或者mRNA的降解,在转录后水平上调控基因的表达。前期的研究表明,雌性飞蝗成虫脂肪体中miRNA的表达受JH调控,干扰Ago1能从功能上阻断miRNA的作用通路,导致蝗虫卵巢发育受到严重抑制,表明miRNA在飞蝗卵子发生中具有重要作用。然而,miRNA在卵黄生成和卵子发生中的分子机制尚不清楚。我们以飞蝗为模式,围绕飞蝗的卵黄生成和卵母细胞成熟,以保幼激素信号通路中的关键基因Kr-h1为中心,在分子生物学、细胞生物学和表观遗传学等层面,探讨miRNA调控飞蝗生殖发育的分子机制。本论文的重点研究内容有两个:一是鉴定调控Kr-h1的miRNA,二是分析候选miRNA对靶标基因Kr-h1的分子调控机制,进而系统阐述miRNA在飞蝗卵黄生成中的功能。在本研究中,首先对雌性蝗虫的脂肪体样本进行转录组的测定,构建miRNA的表达谱。根据表达谱,我们得到了60个保守的miRNA。进一步使用miRanda-3.3a软件预测了调控Kr-h1的miRNA及其结合位点。在人胚肾上皮细胞系HEK293T中,利用双萤光素酶实验证实了let-7a和miR-278可以结合在Kr-h1的CDS区,靶位点的突变以及突变后的双萤光素酶分析证实了以上结论。通过RNA免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)实验,进一步证明let-7a和miR-278能够和Kr-h1在体内发生相互作用。利用qRT-PCR,测定了let-7a和miR-278在脂肪体中的时序表达模式,以及对JH类似物处理的响应,结果表明let-7a和miR-278的表达被JH抑制。通过体内注射miRNA激动剂(agomiR)在飞蝗脂肪体中过表达let-7a和miR-278,然后运用qRT-PCR和Western blot分析的结果显示,过表达这两个miRNA之后,脂肪体中Kr-h1的表达水平显著下降,同时抑制Vg的表达,阻碍卵母细胞的成熟,延缓卵巢的发育。根据以上研究结果,我们认为,在正常状态下,JH抑制let-7a和miR-278的表达,限制其调控Kr-h1的功能,维持JH信号通路的正常强度,保证卵黄生成的正常进行。当let-7a和miR-278异常的过表达以后,Kr-h1的表达受到这两个miRNA的抑制,造成脂肪体内Vg的转录水平显著下降,使得卵母细胞成熟和卵巢发育受到抑制。这些结果表明,let-7a和miR-278通过靶基因Kr-h1参与JH信号通路,调控飞蝗的卵黄生成和卵母细胞成熟。我们的研究从一个方面揭示了miRNA对JH信号通路的作用机制,丰富了昆虫JH信号通路表观遗传调控的基础研究。