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应用 cDNA 微阵列(cDNA microarray)技术筛选肿瘤相关基因是一种快速、有效和高通量方法。我们采用含有 8,400 个基因的 cDNA microarray,筛选在肝癌(HCC)组织中差异表达的基因,获得的基因差异表达谱表明有256 个基因表达上调,267 个基因表达下调。我们选择其中 4 个基因(Beclin 1、RbAp48、Pir51 和 aldolase b)进行 Northern Blotting 及 RT-PCR 验证,结果显示这 4 个基因在肝癌与癌旁组织中差异率大于 50%。其中 Beclin 1、RbAp48 和 Pir51 在检测的 10 例肝癌样品中,在 50%以上的肝癌组织中高表达。在检测的 6 例肝癌细胞系中,大部分细胞中可以检测到它们的表达。aldolase b 在 70%的肝癌样品中表达下降,在 6 种肝癌细胞中,只有HepG2 中有微弱表达。初步表明 Beclin 1、RbAp48、Pir51 和 aldolase b与肝癌相关。 LPTS是我们实验室利用差异表达的EST信息而克隆的一个新的候选肿瘤抑制基因。LPTS 的功能研究表明可以抑制肿瘤细胞的生长,并具有端粒酶抑制活性。LPTS 基因定位于人染色体 8p23 区,该区域是肝癌中发生染色体杂合性缺失(LOH)的高频区。我们在 mRNA 和蛋白质水平检测了 LPTS 基因在肝癌和癌旁组织中的表达。Northern blotting 的检测结果表明 LPTS基因在正常及癌旁组织中表达,在大部分肝癌组织中缺失或低表达。我们制备了特异抗 LPTS 蛋白的多克隆抗体用于 Western Blotting 实验,检测结果表明 LPTS 蛋白在大部分肝癌组织中的表达下调或检测不到。LPTS 基因缺失表达的频率与 LOH 一致。 LPTS 基因对细胞的生长调控和肿瘤的发生有重要意义,但我们对 LPTS基因的作用机制了解甚少。为了深入研究 LPTS 基因的功能,我们采用酵母双杂交技术寻找 LPTS 的相互作用蛋白。我们采用诱导表达系统进行酵母双杂交的筛选,将 LPTS 基因克隆到 pGilda 载体后转入酵母菌株 HLY819,筛选人脑双杂交质粒库,经 GST pulldown 的方法验证后,获得三个阳性克隆编码的肽段可以与 GST-LPTS 相结合,被 pulldown 下来。我们分别克隆了这三个可以与 LPTS 结合的全长新基因,分别命名为 MCRS2、hSMG5 和 LRP。并对这三个基因作进一步的验证和功能研究,叙述如下: 1 <WP=4>MCRS2 的表达是受细胞周期调控的,只出现在S期的早期。MCRS2 与LPTS在体外和体内均可以结合,在细胞内共定位于核仁和端粒上。MCRS2 或 MCRS2的 N 端可以在体外抑制端粒酶活性。长时间过量表达 MCRS2 或其 N 端可以使细胞的端粒变短。我们的结果表明 MCRS2 是受细胞周期调控的 LPTS 结合蛋白,并参与端粒的调控。 hSMG5 是线虫 CeSMG5 的同源物,有 1016 个氨基酸构成。hSMG5 在体外与体内均可以与 LPTS 和 hTERT 相结合。内源性的 hSMG5 主要定位在细胞核周围,当共转 GFP-hSMG5 与 RFP-LPTS,GFP-hSMG5 的定位从细胞质中穿梭到核仁与端粒上。文献报道 SMG5 与 hUpf1 及 hUpf2 结合,并且过量表达 SMG5可以使 hUpf1 的磷酸化状态降低。我们的实验也验证了 hSMG5 与 hUpf1 结合并降低 hUpf1 的磷酸化状态。由于 hUpf1 及 hUpf2 是无意义 mRNA 降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途径中的成员,我们推测 hSMG5可能同时参与 NMD 途径及端粒的调控。 LRP1 编码 756 个氨基酸的蛋白,等电点为 4.5。LRP1 与 LPTS 在体内与体外均可以结合,共定位在核仁与端粒上。体外翻译表明 LRP1 可以从第二个 ATG 起始翻译,产生一个 551 个氨基酸的蛋白 LRP2。在肝癌组织和癌细胞中 LRP1 蛋白的表达升高。过量表达 LRP 可以使细胞端粒变短,导致细胞进入危机期。LRP1 在体外也可以与 hTERT 结合并且抑制端粒酶的活性。我们的实验结果表明 LRP 是一个新发现的 LPTS 结合蛋白,并参与端粒的调控。 近几年来,端粒酶与肿瘤细胞永生关系的确立,使得端粒和端粒酶成为肿瘤分子病理学研究的一个热点,而正常和癌化细胞端粒酶活性的差异也使得端粒、端粒酶成为当今最引人注目的抗肿瘤治疗新靶点之一。LPTS基因产物可直接作用于端粒酶,抑制其活性,是蛋白类端粒酶抑制剂家族中的重要成员,它的表达失调可能直接对端粒酶的活性造成影响,并影响细胞的癌变。进一步对 LPTS 及其结合蛋白的功能、表达调控和作用机理的研究,可以扩大我们对细胞端粒调节机制的认识,提供新的以端粒及端粒酶为作用靶点的肿瘤治疗药物的设计思路。