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具有长波发射的荧光探针在分子识别和荧光成像中具有明显的优越性:长波区发射的荧光能量较低,降低荧光的漂白效应,延长探针分子的使用寿命;避免背景荧光干扰,保证分析结果的准确度;提高了光的渗透能力,减少了细胞成像过程中对细胞的损伤。因此,本文主要针对具有长发射波长(大于600nm)的荧光探针的设计,化合物的发射波长、水溶性和响应时间等识别特性,分别以香豆素,Ru(bpy)32+和Ru(phen)32+为荧光团,设计合成了一系列荧光探针分子,并将它们应用于不同客体的检测,取得了良好的效果。主要工作概述如下:
⑴设计合成了一种含有吡啶酰胺基团的香豆素衍生物(LWZn),并讨论了其作为荧光探针分子对锌离子的识别能力。通过分子共轭结构的扩展,LWZn的发射波长达到620nm;同时通过ICT效应和分子异构化作用调节探针分子的荧光。研究表明,Zn2+的加入使检测液570nm处的荧光增强35倍,而其它金属离子则没有引起明显的荧光增强;络合常数的计算验证了LWZn对Zn2+的识别不受Cd2+存在的干扰。1H NMR,MS和化学计量结果显示LWZn与Zn2+形成1:1配合物的结构,对Zn2+浓度的检测范围为0μM~5μM。此外我们还用激光共聚焦显微镜研究了该探针分子在HepG2细胞内对Zn2+的荧光成像。
⑵设计合成了一种以Ru(bpy)32+为发色团,可用以选择性识别ONOO-的荧光探针分子,Ru(bpy)2[4-(2,2-bipyridin-4-yloxy)phenol]Cl2(RuL)。该分子水溶性好,于600nm处有较强荧光辐射。1H NMR和MS表征证实,ONOO-与探针分子作用时芳氧基苯酚发生去烷基化反应,得到产物RuL’。在pH7.6条件下,RuL’酚羟基发生去质子化,导致荧光猝灭。其他常见活性氧/活性氮化合物,如羟基自由基等,基本不影响RuL的荧光信号。此外,RuL对ONOO-的识别响应迅速,1.5 s内可检测到信号变化,与ONOO-的半衰期为同一数量级。
⑶根据硫醚化合物中硫原子易被氧化成亚砜的机理,设计合成了以Ru(phen)32+为发色团,以硫醚结构为识别位点的荧光探针分子,Ru(phen)2[4,7-bis(octylthio)-1,10-phenanthroline](PF6)2(RSO)和Ru(phen)2[4,7-bis(p-tolylthio)-1,10-phenanthroline](PF6)2(RST)。该系列探针分子均为三菲罗啉钌硫醚结构,发射波长在600~620 nm之间,并具有良好的水溶性。研究表明,用于活性氧/活性氮化合物检测时,NO的加入导致RST荧光完全猝灭,1O2导致部分猝灭,其他活性氧/活性氮化合物则基本无影响,表现出一定的选择性。RSO分子中硫原子活性较高,所有活性氧/活性氮分子均导致RSO的猝灭。