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本课题围绕十二节杆菌J-13产脂肪酶主要进行以下几方面的研究:将橄榄油与聚乙烯醇混合的乳化物为底物添加到筛选培养基中,采用平板检测法,筛选出一株优良的菌株,记为J-13。经上海市疾病预防中心鉴定为节杆菌属十二节杆菌。
对十二节杆菌J-13进行发酵条件优化,最后确定的条件为:0.6%葡萄糖,1%橄榄油,1%大豆色拉油,0.05%MgSO4·7H2O,0.001%CoCl2,1%大豆蛋白胨,1%牛肉膏,1.8%K2HPO4,0.63%NaH2PO4。在5L发酵罐上的培养条件是种子培养时间28小时,接种量3%,28℃培养34小时,可得到较大酶活的脂肪酶,最高为75U/ml。
粗酶经过饱和度为40%~65%硫酸铵的梯度沉淀和Phenyl-Sepharose(HighPerformance)为介质的疏水层析柱层析两步纯化,最后得到目的蛋白的纯化倍数为26倍,产率为24.3%。
十二节杆菌J-13脂肪酶的最适pH是7.0,最适温度为40℃,分子量约33kD。该脂肪酶在16℃以下相当稳定,而当温度高于30℃时,酶活在24小时后有显著下降。K+,Mg2+对其具有激活作用,而Fe2+,Cu2+,Ca2+,Zn2+和Co2+则起抑制作用。