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动物的免疫抑制疾病严重影响着现代畜禽养殖业的发展,给社会发展和人类健康带来了较大的影响,如何增强动物机体免疫力、提高疫苗的免疫效果,成为当今急需解决的问题。刺五加多糖（Acanthopanax senticousus polysaccharide,ASPS）是刺五加干燥的根茎或树皮经水提醇沉提纯得到的多糖,具有增强机体抵抗力、抗肿瘤、抗氧化、调节血脂等生物活性,可以作为一种免疫增强剂来使用。兽医临床发现刺五加多糖具有体内代谢快、生物利用度低等问题,严重限制了其在临床的应用。1.刺五加多糖纳米乳的制备及表征为了解决刺五加多糖在体内代谢快、生物利用度低、部分碱溶性多糖不易溶解等问题,本研究制备了刺五加多糖纳米乳（Acanthopanax senticousus polysaccharide-nanoemulsion,ASPS-NE）,并进行了表征。制备 k-Car-ASPS,作为水相,根据伪三元相图中的纳米乳区域,选择乙醇作为助表面活性剂、Tween-80和Span-80为表面活性剂,液体石蜡、IPM为油相。最终ASPS-NE配方为 Tween-80 46.2%、Span 80 15.4%、乙醇 7.6%、液体石蜡 15.4%、IPM 11.5%、ASPS水溶液3.9%。结果表明制备的ASPS-NE为W/O型纳米乳,分散性良好,ASPS-NE的粒径为35.82±11 nm,粒径分布均匀。ASPS-NE中ASPS的平均含量为25.06 mg/mL。稳定性试验结果表明ASPS-NE有良好的稳定性。2.刺五加多糖纳米乳安全性评价为了评价ASPS-NE在动物临床上使用的安全性,本研究开展了对小白鼠的LD50和对L929细胞的毒性试验。结果显示ASPS-NE的LD50为1157 mg/kg,而空白纳米乳的LD50为1008.2 mg/kg,参考国际上急性毒性分级标准ASPS-NE属于低毒级药物;另外,ASPS-NE在药物浓度≤31.25 μg/mL时为0级毒,表明ASPS-NE细胞毒性低,在兽医临床上使用安全。3.刺五加多糖纳米乳免疫增强机制研究为了研究ASPS-NE的免疫增强作用,用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型,通过研究ASPS-NE对免疫抑制小鼠的脾细胞和巨噬细胞的免疫功能影响、血清中细胞因子表达、外周血CD4+/CD8+的比值及巨噬细胞P65/JNK信号通路相关蛋白的表达情况。结果表明ASPS-NE通过增强脾脏、巨噬细胞等的免疫功能来逆转免疫抑制作用。此外,ASPS-NE诱导了多种细胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ）的分泌,并参与TLR4-NF-κB信号转导通路的免疫调节。初步揭示了ASPS-NE对免疫抑制小鼠的免疫增强作用机制是:ASPS-NE激活P65/JNK/ikkα信号通路和调节Th1/Th2比值调控巨噬细胞免疫活性。4.负载刺五加多糖的碳酸钙纳米粒的制备及质量评价为了研发一种新型的免疫佐剂,本研究制备了 CaCO3、CaCO3-ASPS、CaCO3-ASPS-PEI和CaCO3-ASPS-PPV（PPV,猪细小病毒）纳米粒,并对其进行表征。结果显示纳米粒成球形,颗粒分布均匀,CaCO3、CaCO3-ASPS和CaCO3-ASPS-PPV 的平均粒径分别为 1381±39 nm,2286±54 nm 和 2777±49 nm。PDI值＜0.3。zeta电位增加可以提高提高溶液的稳定性。CaCO3-ASPS纳米粒的zeta 电位为-18.12±1.24 mV,CaCO3-ASPS-PEI 纳米粒的 zeta 电位为 23.81 ±0.38 mV,CaCO3-ASPS-PPV 纳米粒的 zeta 电位为-5.12±0.69 mV,表明 PPV 吸附在 ASPS-CaCO3 表面。与 CaCO3 和 CaCO3-ASPS 相比,CaCO3-ASPS-PPV 表面有可见颗粒,表明PPV吸附成功。纳米粒表面外观粗糙,更有利于ASPS的负载。稳定性试验表明,CaCO3、CaCO3-ASPS和CaCO3-ASPS-PPV纳米粒的PDI值和zeta电位值在28 d内未发现明显变化,PDI＜0.3,表示这些纳米粒在28d 内大小分布均匀。CaCO3-ASPS-PPV 的 AE（%）低于 CaCO3-ASPS,CaCO3-ASPS-PPV的PPV抗原AE在28 d内无明显变化。5.负载刺五加多糖的碳酸钙纳米粒调控自噬通路研究为了研究负载刺五加多糖的碳酸钙纳米粒对自噬通路的调节作用,通过研究CaCO3-ASPS-PEI 对 Raw264.7 细胞内细胞自噬因子（LC3-Ⅰ/Ⅱ、ATG3、ATG5、ATG6/Beclin1、ATG7、ATG9、ATG12、ATG14）蛋白表达影响、自噬因子 mRNA表达影响、自噬因子免疫荧光检测ATG6和LC3-Ⅱ表达、对Raw264.7细胞自噬流的影响等进行分析。结果显示LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达根据药物浓度和作用时间的不同呈现剂量依赖性和时间依赖性,CaCO3-ASPS-PEI可剂量依赖性上调Atg5-Atg12、Atg6/Beclin1、Atg7、Atg14的表达水平。实时荧光定量PCR的数据表明,CaCO3-ASPS-PEI可以剂量依赖性地上调LC3、ATG3、ATG6/Beclin1、ATG9、ATG12的表达水平。免疫荧光检测结果表明CaCO3-ASPS-PEI可以显著上调ATG6/Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白表达水平,CaCO3-ASPS-PEI可以上调LC3的降解率。结果表明CaCO3-ASPS-PEI可以通过促进Raw264.7细胞的自噬水平正向调节细胞免疫反应增强机体的免疫应答。6.负载刺五加多糖的碳酸钙纳米佐剂增强PPV疫苗免疫应答的研究通过测定CaCO3-ASPS-PEI对巨噬细胞活性、MHC Ⅱ和CD86的表达、巨噬细胞分泌的细胞因子、PPV抗原特异性IgG抗体、血清中细胞因子等来研究CaCO3-ASPS-PEI对PPV疫苗的免疫应答作用。结果表明制备的CaCO3-ASPS-PEI能够显著上调CD86和MHC Ⅱ,并激活巨噬细胞,同时促进巨噬细胞产生TNF-α和IL-1β。CaCO3-ASPS-PEI对巨噬细胞具有良好的活化作用,提示CaCO3-ASPS-PEI可能是巨噬细胞有效吸附抗原和促进抗原摄取的有效途径。为了研究CaCO3-ASPS-PEI佐剂的作用,给小鼠注射吸附了 PPV抗原的CaCO3-ASPS-PPV。结果表明CaCO3-ASPS-PPV可以产生PPV特异性的IgG,还可以诱导Th1/Th2混合免疫应答（由Th1主导）。可见开发的CaCO3-ASPS-PEI药物递送系统可以更好的用于诱导抗病毒和抗传染病相关的免疫反应。综上所述,ASPS-NE和CaCO3-ASPS-PEI可作为新型免疫佐剂来增强动物机体的免疫功能。