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第一部分分泌型IL-33质粒和稳转细胞系的构建及其体外生物学功能的检测目的:小鼠分泌型IL-33基因的克隆以及hepa1-6稳转细胞系的构建,研究分泌型IL-33对肝癌细胞增殖、凋亡和周期的影响。方法:提取hepa1-6细胞的总RNA,通过PCR克隆成熟的IL-33编码区(S109到I266),将一段促进IL-33分泌的信号肽Igκ序列通过重叠PCR的方法插到成熟的IL-33序列的5’端,在Igκ5’端以及成熟的IL-33的3’端分别添加BamH I酶切位点,并将其克隆至真核表达载体minicircle母环以及慢病毒载体pRRL-Venus中。利用293T细胞包装慢病毒并感染hepa1-6细胞,经流式分选单个YFP阳性细胞,培养得到稳定表达分泌型IL-33的hepa1-6稳转细胞系。进一步,我们采用CCK8和Ki67实验探究分泌型IL-33对hepa1-6细胞生长和增殖的影响;利用Annexin V和7AAD标记法,采用流式细胞术检测分泌型IL-33对hepa1-6细胞凋亡的影响;同时,我们也进一步研究了分泌型IL-33对hepa1-6细胞周期的调节作用。结果:(1)成功构建分泌型IL-33的真核表达载体minicircle-secreted-IL-33(mini-33)以及慢病毒载体pRRL-Venus-secreted-IL-33(Venus-33);(2)成功构建过表达分泌型IL-33的hepa1-6稳转细胞系;(3)CCK8实验和Ki-67染色结果显示分泌型IL-33显著抑制hepa1-6细胞增殖;(4)细胞凋亡的染色结果表明分泌型IL-33不影响肝癌细胞的细胞凋亡;(5)细胞周期结果显示分泌型IL-33不影响肝癌细胞的细胞周期。结论:成功构建分泌型IL-33的真核表达载体;成功构建了表达分泌型IL-33的hepa1-6稳转细胞系;体外生物学实验表明分泌型IL-33可以抑制hepa1-6细胞的生长和增殖,但不影响hepa1-6细胞的凋亡和细胞周期。为进一步研究分泌型IL-33在肝细胞肝癌发展中的作用及其机制奠定了基础。第二部分分泌型IL-33在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究目的:利用小鼠肝细胞肝癌模型探究分泌型IL-33在肝细胞肝癌发展中的作用及其可能的机制。方法:(1)构建小鼠肝细胞肝癌模型:(a)取对数生长期的表达分泌型IL-33的hepa1-6稳转细胞,PBS重悬单细胞悬液至细胞浓度5×105/ml,每只小鼠注射细胞量为1×106/2 ml,利用高压水流动力学的注射方法将细胞通过尾静脉在5-8s内注射到小鼠体内。3周后处死小鼠,取出小鼠肝脏,称量肝脏重量并计算肝脏肿瘤结节数;(b)利用高压水流动力学的注射方法,将minicircle对照质粒或mini-33质粒(60μg/2 ml)通过尾静脉在5-8s内注射到小鼠体内。一周后,取对数生长期的hepa1-6稳转细胞,PBS重悬单细胞悬液至细胞浓度4×107/ml,每只小鼠注射的细胞量为1×106/25μl,小鼠水合氯醛麻醉,在超净工作台中将小鼠腹部剖开一小口,挤出肝脏一小叶,用胰岛素注射器吸取细胞缓慢的注射入暴露的肝脏中,棉签轻轻按压肝脏止血,再将小鼠伤口缝合,暖光灯照射取暖至小鼠苏醒。原位种植肝癌细胞2周后处死小鼠,取出小鼠肝脏,称量肝脏重量并测量小鼠肿瘤体积;(c)通过胰岛素注射器腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)(25mg/kg)于14日龄的C57BL/6雄性小鼠建立原位肝癌模型,第6周开始,每两个月采用高压水流动力学的方法注射mini-IL-33的真核表达质粒以及minicircle对照质粒,8个月后处死小鼠,计算肝脏肿瘤结节数并测量最大肿瘤的体积。(d)取对数生长期的H22细胞,PBS重悬单细胞悬液至细胞浓度5×107/ml,每只小鼠注射的细胞量为5×106/100μl,选择C57BL/6小鼠左腿腋下处常规消毒,取0.1 ml细胞悬液注射于该部位皮下。第5天开始,每两天测量肿瘤大小。(2)原位种瘤第7天,采用流式细胞术检测mini-33组荷瘤鼠脾脏和肝脏中CD4+T,CD8+T,初始T细胞,效应T细胞,记忆T细胞,NK细胞,Treg细胞,巨噬细胞,中性粒细胞和MDSC等淋巴细胞亚群的变化;以及CD4+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α和CD8+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α的情况。采用Cytometric Bead Array(CBA)染色探究分泌型IL-33对外周血中细胞因子的影响。(3)1 mg/m L anti-CD3以及0.2 mg/m L anti-CD28抗体包被圆底96孔板,4℃孵育过夜,体外分选出7天荷瘤鼠的脾脏的初始T细胞,利用加入重组IL-33蛋白(100ug/ml)的培养基培养分选得到的初始T细胞(1×105/200 ul),经anti-CD3,anti-CD28抗体刺激培养48h后,流式检测CD3、CD4、CD8、CD44、CD62L表面分子的表达情况以及CD4+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α和CD8+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α的情况。(4)取7天荷瘤鼠的脾脏细胞,体外经加了hapa1-6裂解液的含有100单位/ml的IL-2的培养基刺激培养,4天后,按照不同的浓度比与hepa1-6细胞在37℃,5%CO2条件下共培养4小时,通过乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测其对hepa1-6细胞的杀伤效率。结果:(1)成功构建了4种小鼠肝细胞肝癌模型:小鼠高压水流动力学原位肝癌模型、手术原位肝癌模型、DEN诱导肝癌模型、皮下异位肝癌模型。(2)在小鼠高压水流动力学原位肝癌模型中,注射了分泌型IL-33稳转细胞的小鼠的肿瘤结节数显著减少;在手术原位肝癌模型中,HGT注射了分泌型IL-33真核表达质粒的小鼠,肿瘤生长显著减缓,肿瘤体积与对照相比,明显变小;在DEN诱导肝癌模型中,高压水流动力学注射了mini-33真核表达质粒的小鼠肿瘤结节的数量明显减少,相应肿瘤结节的体积也较小;在皮下异位肝癌模型中,注射了mini-33质粒的WT小鼠肿瘤生长与注射了对照质粒的WT小鼠相比,肿瘤生长显著放缓,而注射了分泌型IL-33质粒的ST2-/-小鼠肿瘤生长与注射了对照质粒的ST2-/-小鼠相比没有明显不同。(3)分泌型IL-33能够显著增加脾脏和肝脏中CD69+CD4+T细胞和CD69+CD8+T细胞的比例和数量,并且CD4+T的效应T细胞(CD44+CD62L-)与CD8+T的效应T细胞的比例和数量也相应地升高,CD4+T的初始T细胞(CD44-CD62L+)与CD8+T的初始T细胞的比例则显著减少。(4)分泌型IL-33能够明显增加脾脏中分泌IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞;并能促进肝脏中的CD8+T细胞分泌IFN-γ。(5)分泌型IL-33能够明显提升外周血中IL-12的水平。(6)IL-33蛋白在体外能够直接促进CD4+T细胞和CD8+T细胞的激活,并且促进其分泌IFN-γ和TNF-α。(7)分泌型IL-33能够显著地增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。(8)使用CD4和CD8中和抗体剔除小鼠体内CD4+T和CD8+T细胞,注射表达分泌型IL-33稳转细胞小鼠的肿瘤结节数与注射对照稳转细胞小鼠相比,没有明显差异。结论:分泌型IL-33显著抑制肝细胞肝癌的发展,其机制为分泌型IL-33与受体ST2结合后,促进CD4+T和CD8+T细胞的活化,提高效应CD4+T细胞以及效应CD8+T细胞的比例及数量;同时促进CD8+T细胞分泌IFN-γ,最终抑制肝细胞肝癌的的发生和发展。