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诱导肿瘤细胞凋亡是多种癌症治疗方法之一。在癌症治疗中肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的死亡受体已经成为最具有潜力的治疗靶位点之一。DR4(Death receptor 4)是TNFR超家族成员之一,其分子中具有富含半胱氨酸的胞外结构域和胞内死亡结构域(death domain,DD)。DR4的膜外区与其配体TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)特异性结合后可激活效应分子天冬蛋白酶(caspase),引发凋亡信号途径,最终导致肿瘤细胞凋亡。抗人DR4单克隆抗体能够有效杀死肿瘤细胞,并对正常细胞无细胞毒作用,因而成为抗肿瘤抗体药物研究和开发的热点。但是单抗制备繁琐且成本高,在临床上尚难广泛应用。而多克隆抗体制备简单且价格便宜。因此我们制备了抗人DR4多克隆抗体,初步研究了人DR4多抗诱导HeLa细胞凋亡的效果。本文采用RT-PCR方法从HeLa细胞中成功克隆出人DR4胞外区域(eDR4),通过抗原表位分析选择胞外区域抗原特异性较高的部分序列,构建重组克隆载体pMD-eDR4,测序鉴定正确后构建原核重组表达载体pGEX-DR4并经IPTG诱导在大肠杆菌中获得表达。经Western blot鉴定,证实pGEX-DR4所表达的是融合蛋白GST-DR4。然后采用亲和层析法分离纯化融合蛋白GST-DR4,再通过切胶、透析获得高纯度的融合蛋白GST-DR4.用GST-DR4作为免疫原免疫小鼠制备了抗人DR4多克隆抗体。经过Western blo、ELISA方法鉴定获得了高特异性、效价达1：12800的抗人DR4多克隆抗体。用制备好的抗人DR4多克隆抗体分别处理HeLa细胞和人主动脉平滑肌细胞(HASMC),发现HeLa细胞在形态上有明显的变化,细胞皱缩趋于圆形,核碎裂,形成凋亡小体；而HASMC的形态无变化。MTT法检测结果显示DR4抗体处理后HeLa细胞的生长受到明显抑制,并且随着浓度的降低抑制率逐渐减小,将DR4抗体和DR5抗体同时处理细胞,发现二者具有协同作用,对细胞生长的抑制能力要强于同等浓度下分别作用细胞的DR4和DR5抗体。进一步用TUNEL法、Caspase 3的Western blot检测证实HeLa细胞发生了凋亡。本实验为研发DR4多克隆抗体作为抗癌药物奠定了基础。