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CRISPR/Cas系统在细菌、古生菌和噬菌体中被发现,以序列特异性方式靶向破坏DNA和RNA,以提供了对入侵质粒和病毒的免疫力。其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是广泛应用于各个领域中的基因编辑工具,它是由Cas9蛋白、cr RNA（CRISPR RNA）和tracr RNA（trans-activating cr RNA）组成,在原间隔序相邻基序（protospacer adjacent motif,PAM）序列存在的情况下,单链向导RNA（small guide RNA,sg RNA）引导Cas9蛋白切割DNA双链形成平末端切口。CRISPR/Cas9系统在特定位点诱导产生DNA双链断裂（double-strand breakage,DSB）是基因编辑中的第一步,DSB激活细胞内修复机制才能实现基因编辑的目的。CRISPR/Cas9系统操作简单,打靶效率高,但也存在脱靶效应。脱靶可能会导致基因组不稳定,基因异常表达、细胞死亡或发生肿瘤,并破坏其他正常基因的功能。为了控制CRISPR/Cas9系统的脱靶,会采取一些措施来降低脱靶,如:对影响脱靶效应的相关因素进行优化、改进和检测等。目前,关于脱靶检测的技术层出不穷,单一的脱靶检测手段只能发现小部分的脱靶或者假阳性,结果存在一定的局限性。多个脱靶检测试验结果结合在一起才可能对CRISPR/Cas9系统在动物疾病模型构建中的脱靶效应有更广泛和更深入的理解。我们利用现有的脱靶检测技术,对在小鼠早期胚胎应用Cas9技术产生的脱靶开展一系列的检测研究,主要的研究内容和结果分为以下2部分:第1部分:sg RNA预测脱靶率高低对小鼠胚胎体内外发育的影响。我们利用在线预测脱靶软件在小鼠酪氨酸酶（Tyr）基因上设计了两个潜在脱靶数为18和691的两个sg RNA,通过体外转录的方式,拿到了质量合格的sp Cas9 m RNA、Tyr-low sg RNA和Tyr-high sg RNA,而且它们在小鼠早期胚胎中均有较高的编辑效率,可以很好的应用于随后开展的小鼠早期胚胎Cas9切割产生脱靶的检测研究。随后,我们将Tyr-low sg RNA和Tyr-high sg RNA分别同sp Cas9 m RNA注射至小鼠受精卵中,验证sg RNA预测脱靶率高低对小鼠胚胎卵裂率、囊胚率和足月小鼠出生率的影响。结果显示,Tyr-high sg RNA对小鼠胚胎的卵裂率没有明显的影响,但显著降低了囊胚率和足月小鼠出生率。而Tyr-low sg RNA对小鼠胚胎卵裂率、囊胚率和足月小鼠出生率均无影响。接着对两组新生的小鼠或13.5d解剖的小鼠胚胎进行基因型和表型的鉴定,发现其基因型和表型一致,且两组新生小鼠或13.5d解剖的小鼠胚胎突变率较高。最后根据预测脱靶软件对突变小鼠进行潜在脱靶位点检测,在Tyr-low组的3个预测潜在脱靶位点未发现切割痕迹;在Tyr-high组中,有1个预测脱靶位点同Tyr-high sg RNA无错配碱基,此预测脱靶位点同Tyr-high sg RNA一样存在编辑情况,其余2个预测脱靶位点无编辑情况。而且sp Cas9核酸酶在与sg RNA存在4个碱基错配的其他5个非靶向位点无切割现象,sp Cas9核酸酶特异性高。第2部分:利用DSB识别技术检测Cas9蛋白切割造成的脱靶。我们利用了DSB检测手段,发现直接跟踪Cas9核酸酶诱导产生的DSB可以用来检测Cas9脱靶。通过免疫荧光法检测DSB的响应蛋白γH2AX可以直接观察比较脱靶位点的数量,而且通过适用于少量细胞数目的Cut＆Tag技术可以进行脱靶位点的检测。首先通过γH2AX免疫荧光法去动态检测γH2AX焦点,根据γH2AX焦点的形成和消失动力学特点,追踪DSB的变化。结果表明在小鼠胚胎中DSB的数目在注射后6h开始增加,而注射后9h注射组的DSB的数目明显高于未注射组,注射后15h的DSB数目达到相对最高点,然后开始下降,直到注射后27h注射组的DSB数目与未注射组无明显差异。接着在DSB数目的相对最高点注射后15h时,比较了未注射组、Tyr-low组和Tyr-high组的γH2AX焦点的数目,结果显示Tyr-low组和Tyr-high组Cas9核酸酶切割产生的DSB数目多于未注射组,而Tyr-low组和Tyr-high组的γH2AX焦点数目无明显差异。为了检测Cas9产生的DSB在基因组上的特性,用Cut＆Tag技术对500个注射后15h的早期胚胎细胞进行分析,结果显示在Tyr-low组的18个脱靶位点未发现存在切割情况,但存在很高的非sg RNA依赖的随机切割,经过GO富集分析发现这些非sg RNA依赖的随机切割主要与神经发育和细胞死亡等相关。若这些DSB切割在修复时产生错误,则可能会造成早期胚胎发育停滞甚至致死。总的来说,本研究验证了在线脱靶软件预测脱靶率高的sg RNA存在脱靶,且会降低小鼠胚胎的囊胚率和足月小鼠出生率。其次,CRISPR/Cas9系统的脱靶可以利用在线预测脱靶软件加测序在小鼠模型进行脱靶检测,并通过γH2AX免疫荧光法和Cut＆Tag技术对小鼠早期胚胎进行直观的DSB检测和非sg RNA依赖的DSB检测,这对低脱靶Cas9优化的方向是一个很好的提示。此外,还发现在小鼠胚胎注射后15h存在非sg RNA依赖的随机脱靶,这些脱靶可能与注射胚胎在发育早期死亡有关。利用多种脱靶检测技术分析脱靶,有利于在动物疾病模型构建中降低脱靶效应的产生。