北橐吾黄酮抑菌活性及其作用机制研究

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北橐吾(Ligularia sibirica(L.)Cass.)是一种富含黄酮的多功效药食两用植物,具有抑菌、抗炎、美白、降脂等功效。目前,对于北橐吾黄酮抑菌方面的研究较少,因此从理论上研究北橐吾黄酮天然抑菌防腐的性质具有重要意义。本研究探讨了北橐吾黄酮的抑菌活性和稳定性,并进一步研究了其抑菌机制。本研究以干燥北橐吾为材料,优化北橐吾黄酮提取工艺流程,AB-8大孔树脂分离纯化黄酮初提物,HPLC鉴定主要成分。以E.coli、S.aureus、A.niger和B.yeast为供试菌,利用滤纸片法、抑菌生长曲线,96孔板法研究北橐吾黄酮的抑菌活性。通过测定黄酮对细胞壁膜完整性、通透性和活性氧含量及体内DNA的影响来探究抑菌机理。研究结果表明:采用超声波辅助乙醇提取法,单因素试验确定料液比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间对得率有较大影响,进行响应面优化试验确定最佳工艺参数为:料液比1:32,超声功率305 W,超声时间52 min,乙醇体积分数72%,黄酮得率为2.847%。根据静态吸附实验结果,选取AB-8大孔树脂进行纯化试验,泄露曲线确定最佳上样体积为60 m L,洗脱曲线确定洗脱液最佳用量为80 m L。北橐吾黄酮分离纯化的最佳工艺流程为上样体积60 m L,上样浓度1 mg/m L,上样流速2 m L/min,在p H值为3的条件进行动态吸附,以80 m L90%的乙醇进行动态洗脱。在此条件下,获得的北橐吾黄酮纯度为61.31%。北橐吾黄酮对供试菌抑菌能力强弱为E.coli>S.aureus>B.yeast>A.niger。对E.coli的MIC为0.32 mg/m L,S.aureus和B.yeast为0.64 mg/m L,A.niger为1.28 mg/m L。E.coli的MBC为0.64 mg/m L,S.aureus和B.yeast为1.28 mg/m L,A.niger为2.56 mg/m L。北橐吾黄酮可以抑制E.coli和S.aureus的生长,延缓细菌迟缓期时间,减少菌落数。黄酮对E.coli的抑菌活性最佳,因此选作抑菌作用机制试验的供试菌。采用滤纸片法研究北橐吾黄酮的抑菌作用稳定性,选取5 mg/m L的北橐吾黄酮溶液,北橐吾黄酮溶液分别经不同的p H(5~10)、紫外线照射(1 h~3 h)、温度(20℃~121℃)和离子强度(0.1 mol/L~0.6 mol/L)等条件处理。结果表明,北橐吾黄酮抑菌活性不受离子强度影响,高温、紫外线照射和碱性环境则会破坏北橐吾黄酮稳定性,因此北橐吾黄酮应在常温和酸性条件下保存使用,避免紫外线照射。以E.coli为供试菌,扫描电镜观察微观形态、测定PI和DCFH-DA探针荧光强度,电导率仪测定离子浓度,琼脂糖电泳实验测定DNA含量变化。试验结果显示,北橐吾黄酮改变了E.coli的微观形态,MIC黄酮处理后的E.coli表面变得粗糙干瘪,无明显生物膜,细胞变短。PI荧光强度值随浓度升高而增大,表明细胞膜完整性随着北橐吾黄酮浓度增加被破坏的越来越严重。电导率测定的离子浓度变化表明,北橐吾黄酮可以改变细胞膜的通透性,使Na+、K+等小分子物质外流。DCFH-DA荧光值在添加北橐吾黄酮后显著增加,细菌体内ROS含量提高。添加MIC的北橐吾黄酮后E.coli体内的DNA含量减少,无法完成正常的复制转录表达,表明北橐吾黄酮是通过破坏E.coli的细胞膜完整性、通透性以及破坏其DNA等作用机制发挥其抑菌作用。
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