梅花休眠相关DELLA基因的克隆与功能分析

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梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus),是中国的传统名花,在中国已有3000年的栽培历史。相对于其它李属植物,在长江流域及以南地区,它花期最早,能够在早春盛放。李属落叶树种正常的开花需要满足一定的需冷量。需冷量满足后,在适宜的环境条件下,植物内休眠解除,芽萌发。前人的研究发现,赤霉素可以促进多种木本植物芽内休眠的解除,但赤霉素对梅花芽休眠解除研究鲜有报道。赤霉素促进种子休眠解除的分子机理已经研究的很透彻,但赤霉素对木本植物芽休眠的解除分子机理研究很少。DELLA基因作为赤霉素信号转导途径中的关键调控子,它在许多赤霉素调控植物生长发育过程中(如种子萌发,根、茎的发生等)的作用已经得到详细的诠释,但对赤霉素调控的梅花芽休眠解除过程中的作用未见报道。为研究赤霉素对梅花芽休眠的解除效果,探索赤霉素调控梅花芽休眠解除的分子机制以及DELLA基因对梅花芽休眠解除的作用,本论文以梅花品种‘长丝绿萼’、‘粉红朱砂’和‘明晓丰后’为试材,研究了梅花芽自然休眠期内激素的变化、梅花赤霉素处理芽休眠解除效果、梅花赤霉素调控路径中的关键基因家族GRAS的全基因组分析以及该基因家族中DELLA基因的克隆、表达和功能验证。论文主要结论如下:1.根据0-7.2℃需冷量估算模型,‘长丝绿萼’和‘粉红朱砂’内休眠解除所需需冷量较低为241h;‘明晓丰后’内休眠解除所需需冷量较高约为579 h。3个品种在自然休眠解除前,均出现了GA3含量的上升。GA3很可能部分的抵消ABA对植物芽的抑制作用,促进植物芽萌发。2.在休眠期内,喷洒50mg/L和100mg/LGA3溶液处理‘粉红朱砂’,分别使处理组的萌芽率比对照组高出25%和32%。喷洒50 mg/L GA3溶液处理休眠期内的‘明晓丰后’可使‘明晓丰后’完全解除休眠,并比自然解除休眠的时间提早31d。3.全基因组分析共鉴定出46个GRAS基因家族基因,分析阐述了GRAS基因家族的进化过程,预测了这些基因在根、茎、叶、花发育和果发育中的功能,并确定出梅花中可能具有赤霉素信号调控功能的DELLA基因2个,它们是PmGRAS16和PmGRAS26。利用梅花全基因组数据,试验分别对46个GRAS基因进行了理化性质分析、结构域分析、基因结构分析、系统进化分析、染色体定位分析和组织器官表达分析。结果显示:46个基因都含有GRAS基因家族所特有的重要结构域,均为亲水蛋白,其中45个基因被定位在梅花8条连锁群上。84%的基因不含内含子。根据进化树的拓扑结构,46个梅花GRAS基因蛋白序列共形成了11个组,X组为梅花中特有的GRAS基因家族基因,IX组基因很有可能是在单子叶和双子叶分化前就已经存在,并保留下来。DELLA亚家族的两个基因PmGRAS16和PmGRAS26属于片段重复事件形成一对同源基因。11个基因在根中高度表达;4个基因在叶中高度表达;6个基因在茎中高度表达。4.对2个梅花中的DELLA基因(重命名为PmDELLA1和PmDELLA2)进行了基因克隆、表达分析和转基因拟南芥功能验证分析。2个PmDELLA基因在需冷量高的梅花品种‘明晓丰后’中芽休眠解除过程中出现显著下调,但是2个基因在需冷量低的品种‘长丝绿萼’休眠解除过程中功能上存在差异。转基因株系表现出GA缺失表型,并且对GA3的响应被显著削弱。过量表达PmDELLA1和PmDELLA2基因的转基因株系表现为叶盘缩小、株高减少和花期延迟等表型。2个基因的转基因株系分别与对照相比,下胚轴的长度差值存在显著性差异。本论文揭示了赤霉素对梅花芽休眠的调控作用,并验证了PmDELLAl和PmDELLA2在梅花生长发育中起到调控GA信号释放的功能,进而与GA调控梅花芽休眠解除产生内在的联系。这些分析为不仅为梅花而且也为其它蔷薇科树种芽休眠解除的分子机理的揭示提供有价值的参考信息。
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