论文部分内容阅读
嗜热不放氧光合细菌Chloroflexus aurantiacus是最早发现的绿色非硫细菌,它和绿硫细菌最大的共性就是都有捕光天线——绿小体的存在。绿小体是生物体中最大的捕光天线结构,由单层膜包被,内部是细菌叶绿素c聚集形成的管状结构。细菌叶绿素c捕获光能后将能量传递给膜上的细菌叶绿素a,进而传递给光合反应中心。基片层(baseplate)是位于绿小体与细胞膜结合处的特殊构件,不仅起着连接的作用,同时也是绿小体内捕获的光能传递进入光合膜的重要调控枢纽。前期研究中发现基片层主要成分是CsmA蛋白。为了阐明基片层在光能传递过程中的机制和作用,需要深入研究CsmA蛋白。本研究采用分子生物学和蛋白质化学等技术对CsmA蛋白展开了如下研究：(1)以Cfx. aurantiacus基因组为模板,根据NCBI中已知的Cfx. aurantiacus的csmA基因序列设计了特异性引物,PCR扩增后TA克隆进而重组到表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源过表达；(2)用双引物法对CsmA蛋白的第25位氨基酸残基进行了定点突变,突变为不带电荷的丙氨酸(Ala),成功构建了突变型CsmAH25A蛋白的表达载体,用来探究CsmA蛋白的色素结合位点；(3)标签蛋白经IPTG诱导表达后,发现主要以包涵体形式存在。因此,进行了在Ni-NAT柱上的包涵体复性和凝血酶酶切等实验。结果表明：表达的标签蛋白结合到亲和柱上后,在低温16℃、低流速(0.5ml/min)和温和的尿素梯度(8M-0M)等条件下,可以成功复性目的蛋白,复性效率达41%。凝血酶的柱上酶切效率在室温16℃、反应20h和每克目的蛋白加0.7U的凝血酶量时达到最高。(4)复性纯化的两种蛋白分别与HPLC制备的细菌叶绿素a进行体外功能重组后,利用吸收光谱等手段对重组产物进行初步分析和鉴定,结果表明CsmA的第25位组氨酸残基是细菌叶绿素a结合的关键位点。本研究将为嗜热光合绿丝菌绿小体基片层结构与功能的进一步研究提供理论基础。