胃癌是一种威胁人类健康的全球性疾病。胃癌的治疗包括手术、化疗、放疗、生物治疗、分子靶向治疗等综合性治疗。其中,手术切除原发性肿瘤和清扫区域淋巴结仍是治疗胃癌的首选。近年来,尽管外科技术有了很大发展,抗癌药物有了很大改进,然而胃癌死亡率仍高居不下,占我国恶性肿瘤死亡率的第一位,全球癌症死亡的第二位。因此,对其病因、病理学,以及新的治疗方法的探讨是目前亟待解决的课题。膜联蛋白A7(Annexin A7)也称为会联蛋白(synexin),属于膜联蛋白A家族,膜联蛋白A家族由13个(Annexin A12有争议)显著生物学和结构同源性钙或钙和磷脂结合蛋白质组成(40-60%)。膜联蛋白的表达变化与细胞转化、肿瘤进展和转移密切相关。研究证明,膜联蛋白A7在多数胃肠肿瘤中起原癌基因的功能,但关于膜联蛋白A7对胃癌的发生、发展的影响目前仍知之甚少。本研究分别以人不同分化胃癌组织、胃癌细胞株、裸鼠移植瘤为研究对象,应用常规病理、免疫组织化学、免疫细胞化学、蛋白印迹法(western blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)、噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞术、细胞划痕实验以及Transwell小室等方法研究Annexin A7在胃癌组织中的表达及其与胃癌生物学特性的关系;观察Annexin A7在不同分化胃癌细胞株中的表达以及抑制Annexin A7对人低分化胃腺癌细胞株BGC-823细胞增殖、侵袭转移的影响;进而通过抑制Annexin A7表达,观察其对人低分化胃腺癌细胞株BGC-823裸鼠移植瘤增殖及侵袭转移的影响,阐明Annexin A7在胃癌增殖、侵袭和转移中的作用,为胃癌病情的综合评估和分子靶向性治疗提供依据。本研究共分为五个部分:第一部分膜联蛋白A7在不同分化的胃癌组织及癌旁组织中的表达及其与胃癌生物学特性关系的研究目的:观察膜联蛋白A7(Annexin A7)在胃癌(及癌旁)组织中的表达,并探讨其与胃癌分化程度和淋巴转移的相关性。方法:收集患者的胃癌(癌旁)组织标本及临床和病理资料。使用免疫组化和Western blot观察Annexin A7在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况;采用Logistic回归分析Annexin A7的表达与胃癌分化程度的相关性;使用ROC曲线确定预测胃癌淋巴转移的Annexin A7相对表达量截点值。结果:免疫组化结果发现Annexin A7表达阳性率65.4%,明显高于癌旁组织31.5%。Annexin A7表达阳性的胃癌患者生存率明显低于Annexin A7表达阴性的患者(p<0.001)。COX回归分析发现Annexin A7表达阳性与胃癌组织病理分型与胃癌患者预后不佳密切相关。western blot结果发现淋巴结转移阳性(PN1-3期)的患者Annexin A7相对表达量明显高于淋巴结转移阴性(PN0期)患者(0.56±0.09 vs.0.42±0.07,p<0.05)。通过ROC曲线分析western blot测得的Annexin A7的相对表达量对胃癌患者淋巴结转移的预测价值。结果发现,以相对表达量>0.505为截点值,Annexin A7的相对表达量对胃癌患者淋巴结转移预测的敏感性为76.7%,特异性为88.3%。小结：1 Annexin A7在胃癌组织中表达高于癌旁组织;2 Annexin A7表达阳性胃癌患者生存率低;3 Annexin A7高表达与胃癌组织低分化相关;4 Annexin A7表达阳性可作为胃癌淋巴结转移的预测因素。第二部分膜联蛋白A7在不同分化人胃腺癌细胞株中的表达目的:观察膜联蛋白A7(Annexin A7)在不同分化程度人胃腺癌细胞株中的表达,探讨其表达与胃癌细胞分化程度的关系。方法:体外培养人高分化胃腺癌细胞株MKN-28、人中分化胃腺癌细胞株SGC-7901和人低分化胃腺癌细胞株BGC-823。分别采用免疫细胞化学染色、蛋白印迹法(Western blot)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)等方法观察Annexin A7在不同分化程度的人胃腺癌细胞株中蛋白和m RNA的表达情况。分析Annexin A7表达与胃腺癌细胞分化程度的相关性。结果:免疫细胞化学染色结果显示,MKN-28细胞株和SGC-7901细胞株Annexin A7的染色较浅,BGC-823细胞株Annexin A7的染色较深。应用Western blot对不同分化程度人胃腺癌细胞中Annexin A7的蛋白表达情况进行分析,结果发现:不同分化程度的人胃腺癌细胞中Annexin A7的蛋白表达情况存在明显差异,MKN-28、SGC-7901和BGC-823细胞株中Annexin A7蛋白相对表达量分别为0.287±0.030、0.421±0.047和0.676±0.048;q RT-PCR结果显示,Annexin A7的m RNA的相对表达量由低到高依次为:高分化腺癌细胞株MKN-28(1.004±0.111)、中分化腺癌细胞株SGC-7901(1.534±0.028)、低分化腺癌细胞株BGC-823细胞株(2.185±0.324)。小结：1 Annexin A7在MKN28细胞株中表达最低,在BGC823细胞株中表达最高;2 Annexin A7表达强度与胃癌细胞分化程度负相关,分化程度低的胃癌细胞Annexin A7表达高,分化程度高的胃癌细胞Annexin A7表达低。第三部分抑制膜联蛋白A7基因表达对人低分化胃腺癌BGC823细胞增殖活性影响及机制的研究目的:探讨si RNA抑制膜联蛋白A7(Annexin A7)基因表达对人胃癌BGC823细胞增殖活性的影响。方法:构建针对Annexin A7的si RNA序列3条,非特异性si RNA序列1条,筛选鉴定效果最佳的Annexin A7-si RNA;应用Annexin A7-si RNA转染人低分化胃腺癌细胞株GBC823;MTT法检测细胞生长曲线;流式细胞技术检测细胞周期;应用Western blot和q RT-PCR检测细胞增殖相关基因PCNA、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A和p16、p21、p27蛋白及m RNA表达的改变。结果:成功构建Annexin A7-si RNA转染体系,并在80n M浓度Annexin A7-si RNA-3处理48h时,其转染效率最高,达90%以上。采用80 n M的Annexin A7-si RNA-3转染BGC823细胞48h,MTT实验发现,与control组及NS-si RNA组相比,Annexin A7-si RNA组细胞增殖活性明显降低。流式细胞周期实验结果表明:与control组及NS-si RNA组相比,Annexin A7-si RNA组处于S期的细胞明显减少,而处于G0/G1期的细胞显著增加(均P<0.01)。Western blot以及q RT-PCR检测干扰Annexin A7表达后BGC823细胞增殖相关基因表达的改变,与control组及NS-si RNA组相比,Annexin A7-si RNA组可见PCNA、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A的蛋白和m RNA表达明显下调,而p16、p21、p27的蛋白和m RNA表达显著升高。NS-si RNA组对上述指标与control组相比无明显影响。小结：1成功构建Annexin A7-si RNA序列3条,其中Annexin A7-si RNA-3在80n M浓度处理48h时,其转染效率最高,抑制Annexin A7效果最好;2抑制Annexin A7表达后BGC823细胞活性降低;3抑制Annexin A7表达后BGC823细胞增值受到抑制,处于S期的细胞明显减少,而处于G0/G1期的细胞显著增加;4抑制Annexin A7在BGC823细胞中表达,可能是通过下调PCNA、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A,同时上调p16、p21、p27,从而在胃癌细胞的增殖过程中发挥重要作用。第四部分抑制膜联蛋白A7基因表达对人低分化胃腺癌BGC823细胞迁移和侵袭能力影响及机制的研究目的:探讨抑制膜联蛋白A7(Annexin A7)基因表达对人胃腺癌BGC823细胞迁移和侵袭能力的影响。方法:应用Annexin A7-si RNA转染人胃癌低分化细胞株BGC823,通过划痕实验和Transwell小室模型分析Annexin A7对BGC823细胞迁移和侵袭的影响。以Western blot及q RT-PCR技术观察抑制Annexin A7表达对BGC823细胞黏附、迁移和侵袭相关分子TIMP-1、TIMP-2、ICAM-1、MMP-1、MMP-2以及MMP-9的蛋白和m RNA的表达情况。结果:与control组及NS-si RNA组相比,Annexin A7-si RNA组的平面迁移活性、跨膜迁移活性及细胞迁移率均受到明显抑制(p<0.05)。Western blot和q RT-PCR结果显示:与control组及NS-si RNA组相比,Annexin A7-si RNA组MMP-2、MMP-9、ICAM-1的蛋白和m RNA表达明显下调,而MMP-1、TIMP-1、TIMP-2蛋白和m RNA表达未见明显变化。小结：1抑制Annexin A7表达后BGC823细胞平面迁移活性降低;2抑制Annexin A7表达后BGC823细胞跨膜迁移活性及细胞迁移率均受到明显抑制;3抑制Annexin A7在BGC823细胞中表达,可能是通过下调中ICAM-1、MMP-2和MMP-9,从而在胃癌细胞的迁移和侵袭过程中发挥重要作用。第五部分抑制膜联蛋白A7基因表达对人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤增殖、侵袭和转移影响及其机制的研究目的:探讨抑制人低分化胃腺癌细胞株BGC823中Annexin A7的表达对人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤增殖、侵袭和转移的影响。方法:将人低分化胃腺癌细胞株BGC823注入裸鼠右侧腋下部皮下,构建皮下移植瘤模型,成瘤后将重组质粒Annexin A7-sh RNA、NS-si RNA(NS-si RNA组)及saline(control组)注入瘤内,观察并测定裸鼠移植瘤的成瘤情况。病理切片HE染色观察各组移植瘤肿瘤组织,免疫组织化学、western blot和q RT-PCR方法检测Annexin A7在各组移植瘤组织中的蛋白和m RNA表达;采用免疫组织化学、western blot和q RT-PCR方法检测PCNA、P27、MMP-2和TIMP-2在移植瘤组织中蛋白及m RNA的表达水平。结果:Annexin A7-si RNA组裸鼠皮下移植瘤的体积及重量均小于control组和NS-si RNA组(p<0.05)。HE染色病理切片显示:与control组和NS-si RNA组相比,Annexin A7-si RNA组肿瘤较对照组肿瘤细胞明显稀疏。免疫组化、western blot和q RT-PCR发现,与control组和NS-si RNA组相比,Annexin A7-si RNA组的Annexin A7的蛋白及m RNA表达下调。免疫组化、western blot和q RT-PCR结果发现,Annexin A7-si RNA组下调PCNA、MMP-2的蛋白及m RNA表达,同时上调P27的蛋白及m RNA表达。小结：1成功构建BGC823细胞裸鼠皮下移植瘤模型;2抑制BGC823细胞Annexin A7表达后可使移植瘤体积减小、重量减轻;3抑制BGC823细胞Annexin A7表达后可使肿瘤细胞排列明显稀疏;4抑制BGC823细胞增殖及侵袭和转移功能的机制可能是其通过下调PCNA、MMP-2表达,同时上调P27表达,进而影响细胞周期的进程,使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移过程下调,从而发挥抗肿瘤的作用。结论：1 Annexin A7表达与胃癌生物学特性相关;其在胃癌组织中表达高于癌旁组织;在低分化胃癌组织中表达高于高中分化胃癌组织;表达阳性的胃癌患者生存率低;Annexin A7高表达可作为胃癌淋巴结转移的预测因素。2不同分化程度的胃腺癌细胞中Annexin A7表达存在差异;胃癌细胞分化程度越低,Annexin A7表达越高;胃癌细胞分化程度越高,Annexin A7表达越低。3成功构建Annexin A7-si RNA序列3条,其中Annexin A7-si RNA-3在80n M浓度处理48h时,其转染效率最高,抑制Annexin A7效果最好;抑制Annexin A7表达后BGC823细胞活性降低、细胞增值受到抑制,处于S期的细胞明显减少,而处于G0/G1期的细胞显著增加;下调BGC823细胞中PCNA、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A,同时上调p16、p21、p27,从而在胃癌细胞的增殖过程中发挥重要作用。4抑制Annexin A7表达后BGC823细胞平面迁移活性降低;细胞跨膜迁移活性及细胞迁移率均受到明显抑制;下调BGC823细胞中ICAM-1、MMP-2和MMP-9,进而抑制BGC823细胞迁移和侵袭。5成功构建BGC823细胞裸鼠皮下移植瘤模型;抑制BGC823细胞Annexin A7表达后可使移植瘤体积减小、重量减轻;可使肿瘤细胞排列明显稀疏;抑制BGC823细胞增殖及侵袭和转移功能的机制可能是其通过下调PCNA、MMP-2表达,同时上调P27表达,进而影响细胞周期的进程,使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移过程下调,从而发挥抗肿瘤的作用。6 Annexin A7可能是一个重要的分子靶点,通过抑制Annexin A7表达可发挥抗胃癌的作用。