激素诱导的成骨细胞中Atg12和LC3表达的实验研究

来源 :内蒙古医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:XP19830828
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目的:观察激素对家兔股骨成骨细胞模型中自噬相关基因Atg12和LC3的表达情况,探讨自噬在激素性股骨头缺血坏死中的作用。  方法:取8周龄的新西兰雄性大白兔1只,无菌解剖,取股骨,除去表面肌肉组织,PBS洗净骨表面。将股骨两头剪开,用PBS冲出里面骨髓,洗净后,将骨剪碎,基础培养基清洗一次,加入一型胶原酶消化15-20min,加完全培养基终止消化。使用100目滤网过滤,滤液离心,收取沉淀;加入完全培养基重悬细胞沉淀,接种至培养皿或培养瓶中,37℃5%CO2培养。之后将正常培养的成骨细胞分为5组,分别为不做激素处理的正常成骨细胞组(对照组),以及加入1uM甲基强的松龙之后分别培养12、24、48、72小时的实验组。采用单丹磺酰尸胺(MDC荧光染色)检测各组成骨细胞自噬的情况。采用Western blot方法检测成骨细胞中Atg12和LC3蛋白表达的变化。采用定量PCR方法检测成骨细胞中Atg12和LC3mRNA表达变化。最后使用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析。  结果:1、电镜下,与未使用激素组(对照组)相比,使用激素后12h、24h、48h、72h五组成骨细胞中自噬泡明显增多。各组的平均荧光强度分别为:0.11、0.18、0.22、0.25、0.28。2、定量PCR检测:结果以GAPDH做为内参蛋白。未使用激素组(对照组)和使用激素后12h、24h、48h、72h后Atg12mRNA的表达值分别为:1、1.422(p=0.0027)、1.568(p=0.0004)、2.230(p=0.0020)、2.852(p=0.0001)。LC3mRNA的表达值分别为:1、1.218(p=0.0102)、1.6657(p=0.0026)、1.8050(p=0.0002)、2.0147(p=0.0001)差异具有统计学意义(P<0.05)。激素处理的成骨细胞中Atg12和LC3的mRNA表达量较对照组明显增高,且随着激素作用时间的延长,mRNA的表达量呈现逐渐上升的趋势。即激素作用时间越长,Atg12和LC3的mRNA表达量越高。3、Western blot检测:与对照组相比,激素处理的成骨细胞中Atg12和LC3蛋白的阳性表达条带明显增宽,且随着激素处理成骨细胞时间的延长,阳性表达条带逐渐增宽,说明,随着激素作用时间的增加,Atg12和LC3蛋白的表达逐渐增加。  结论:激素可诱导家兔股骨成骨细胞模型中自噬及其相关基因Atg12和LC3的表达增高,且具有随着激素作用时间的增加而表达增强的特点。表明自噬在激素导致的股骨头缺血坏死中具有重要作用。
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