本论文共分为四章内容。一、文献研究本章是在对相关文献进行查阅和分析的基础上,较为系统地归纳和总结了大枣主要活性成分及其生物活性,并对中医脾虚证病理特征与动物模型构建研究进展进行了综述,以期为大枣补脾益胃功效物质基础及其作用机制研究提供思路与参考,为大枣资源的开发利用提供依据。二、基于肠道菌群和代谢组相关联的大枣补脾益胃作用机制研究(一)基于苦寒泻下致脾虚动物模型的大枣补脾益胃作用机制研究1、采用番泻叶建立脾虚大鼠模型,造模同时给药大枣。给药10天后,收集大鼠血液、尿液、脾脏和小肠组织,进行血常规、生化指标以及小肠组织病理分析,评价大枣对番泻叶所致脾虚模型大鼠的保护作用。结果显示,造模后大鼠体重增长率、血清淀粉酶、D-木糖、胃泌素水平均显著降低,脾脏指数、血清胆碱酯酶、生长抑素水平显著升高,血常规指标有明显改变,小肠部位出现损伤。给药大枣后,上述指标均趋于正常水平。表明大枣可能是通过调节消化系统、免疫系统以及能量代谢来实现其补脾益胃功效。2、采用代谢组学方法确定与大鼠脾虚模型相关的代谢变化以及大枣的干预作用。共鉴定出31种差异内源性代谢物(血浆22种,尿液9种),给予不同剂量的大枣后,27种代谢差异物不同程度地趋向正常水平(P<0.05),这些内源性代谢物主要参与视黄醇代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化代谢、烟酸和烟酰胺代谢、醚脂代谢和硒氨基酸代谢途径。结果提示,大枣对番泻叶所致脾虚大鼠有较好的调控作用,并从代谢组学方面揭示了大枣补脾益胃功效的潜在生物学机制。3、采用16S rDNA测序技术研究番泻叶致脾虚大鼠肠道菌群结构及多样性,并探究大枣对脾虚大鼠肠道菌群结构的调节作用。LEfSe分析结果显示,与空白组相比,脾虚模型组大鼠粪便中从门到属分类水平上均发现差异菌群。在属分类的菌群中共发现31个差异菌属,给药大枣后,能显著改善脾虚引起的Allobaculum、Turicibacter、棒杆菌属、变形菌属、气球菌属、肠球菌属、Epulopiscium、摩根氏菌属、柯林斯氏菌属和短小芽孢杆菌属相对丰度升高。提示大枣可通过改善脾虚大鼠的肠道菌群结构失调达到治疗作用。4、应用R语言对鉴定出的31种潜在生物标志物和肠道菌差异菌群(门和属水平)计算皮尔逊相关系数生成相关矩阵,构建脾虚病理状态下肠道微生物与宿主代谢组交互关系图。结果显示,气球菌属与尿液中潜在生物差异物烟酸胺、17α-hydroxypregnenolone、维生素A呈正相关,而大枣能显著降低气球菌属的相对丰度。推测脾虚泻下造成的气球菌属相对丰度升高,而其升高后又通过影响视黄醇代谢、烟酸和烟酰胺代谢推动脾虚的病理进程,气球菌属可能是预测和治疗脾虚和相关紊乱代谢通路的候选菌种。(二)基于炎症性肠病动物模型的大枣补脾益胃功效物质及作用机制研究1、利用5%葡聚糖硫酸钠,建立炎症性肠病大鼠模型,给药大枣及各化学组分后,均可回调模型组大鼠的DAI值,改善血常规指标,显著降低结肠组织中炎症相关因子IL-6、IL-10和TNF-α的含量,减轻结肠组织损伤。各给药组对炎症性肠病的相关指标的干预作用不完全一致,提示大枣不同化学组分对炎症性肠病大鼠的调节作用呈现出一定的差异性,推测大枣发挥改善炎症性肠病作用的机制为其各化学组分的共同作用。2、采用代谢组学研究方法研究与炎症性肠病相关的代谢变化和大枣及各化学组分的干预作用。共鉴定出43种差异内源性代谢物(血浆13种,尿液30种),主要涉及烟酸和烟酰胺代谢、泛酸和CoA生物合成、花生四烯酸代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等代谢途径,与番泻叶所致脾虚模型有部分重合。大枣及各化学组分干预后,对部分差异内源性代谢物具有回调作用,但各组分作用趋势不完全一致,其中高剂量大枣调控差异代谢物的数量最多。利用Western blotting技术对花生四烯酸代谢通路进行验证,发现大枣及其各化学组分能不同程度显著抑制通路中PLA2、COX2和5-LOX蛋白的表达。结果提示,大枣具有较好的改善炎症性肠病作用,推测其物质基础为各化学组分的共同作用,并从内源性代谢物角度揭示了大枣改善炎症性肠病的可能作用机制。3、采用16S rDNA测序技术研究大枣及各化学组分对炎症性肠病大鼠肠道不同部位菌群多样性的调节作用。研究发现,炎症性肠病大鼠盲肠部位肠道菌群整体结构未有显著改变,菌群多样性从结肠部位开始发生显著紊乱,且结肠内容物与粪便均找出差异菌属27种,约有50%重合。高剂量大枣总提物与三萜酸组分对结肠部位肠道菌群有较好的调节作用,大枣及各化学组分均可不同程度地改善失衡的粪便菌群结构。4、应用R语言对鉴定出的43种潜在生物标志物和差异菌群(门和属水平)计算皮尔逊相关系数生成相关矩阵,构建炎症性肠病状态下肠道微生物与宿主代谢组交互关系图。结果显示理研菌属与4,6-二羟基喹啉、尿刊酸、烟酸单核苷酸呈正相关,在炎症性肠病大鼠中理研菌属的相对丰度显著降低。推测炎症性肠病导致其相对丰度降低,从而影响到肠道屏障功能以及组氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢,推动了炎症性肠病的发展,理研菌属可能是预测和治疗炎症性肠病和相关紊乱代谢通路的候选菌种。三、基于小鼠胃肠道系统的大枣与巴豆霜配伍减毒机制研究1、基于正常小鼠,通过尿量测定、生化指标检测以及小肠组织病理分析,研究大枣对巴豆霜胃肠毒性及利尿效应的干预作用。结果表明,大枣与巴豆霜合用可减缓巴豆霜的快速利尿作用,显著上调单用巴豆霜后下降的血清白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、胃泌素(GAS)和生长抑素(SS)水平,减轻巴豆霜导致的小鼠小肠组织损伤。研究结果提示大枣与巴豆霜配伍应用可在血清免疫指标、肠道运动、肠道损伤等方面表现出一定的配伍减毒作用趋势。此外,大枣尚可减缓巴豆霜的逐水药势,呈现出一定的降效作用。2、基于正常小鼠,利用16S rDNA测序方法研究巴豆霜和大枣配伍前后肠道菌群的变化。结果表明,大枣与巴豆霜合用可改善巴豆霜引起的肠道菌群失调。大枣合用低剂量巴豆霜后可使升高的鞘氨醇单胞菌属、颤螺菌属的相对丰度显著降低,大枣合用高剂量巴豆霜后致病菌属嗜胆菌属水平降低。研究结果提示大枣与巴豆霜配伍应用可在肠道菌群结构方面表现出一定的配伍减毒作用趋势。四、大枣三萜酸类活性组分的体内药代动力学研究1、建立超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS/MS)方法,用于同时测定正常和免疫抑制大鼠血浆样品中的7种大枣三萜酸类组分。方法学验证结果显示,7种三萜酸成分在血浆中的线性关系良好,精密度、准确度、提取回收率、基质效应以及稳定性均在标准范围内。结果显示,在免疫抑制病理状态下,表美洲茶酸的AUCo-t和AUC0～∞显著高于正常大鼠,CLz/F显著降低;麦珠子酸AUC0-t、AUC0～∞和Cmax显著低于正常大鼠,而CLz/F则显著高于正常大鼠。该结果将为大枣三萜酸类组分免疫调节临床应用提供参考。2、利用已建立的UHPLC-MS/MS方法同时定量测定正常和四氯化碳诱导急性肝损伤大鼠模型血浆样品中的7种大枣三萜酸类组分。结果表明,模型组与正常组之间7种三萜酸的药代动力学参数存在显著差异。在急性肝损伤病理状态下,表美洲茶酸和坡模堤酮酸的AUC0-t和AUC0-∞显著高于正常大鼠,其CLz/F则显著降低。与之相反,麦珠子酸、白桦脂酸和白桦脂酮酸的参数呈现出截然不同的趋势。该药代动力学研究将为大枣三萜酸类组分防治肝损伤临床应用提供参考。