前言：前交叉韧带(ACL)损伤后往往出现关节稳定性差,引起膝关节反复损伤,这样会加快关节软骨逐步退化。膝关节交叉韧带重建术后的腱骨愈合是一个非常复杂和漫长的过程,长期以来一直是运动医学领域治疗的热点、难点问题。目前所有针对交叉韧带重建术后促进腱骨愈合的方法很多,但远期疗效均不是十分理想,在这种情况下,作为一种可选择性的替代疗法,以干细胞为核心的组织工程方法为促进腱骨愈合提供了新的方法。通常组织工程方法促进隧道内的腱骨愈合需要具备以下三个条件：首先组织来源的干细胞数量必须充足,生物功能正常,具有向成骨分化能力的种子干细胞；其次需要具备良好生物相容性,可以细胞无毒性降解、孔隙直径和孔隙率适合的三维生物支架；最后需要包含有调节种子干细胞增殖、分化并能维持干细胞表型特征的细胞生长因子。骨膜来源干细胞(Periosteum-Dirved Stem Cells, PDSCs)是来自骨膜内层的成体干细胞,由于其比其他成体干细胞来源充足,取材方便,而且在体外培养的条件下骨膜来源干细胞具有很强的传代增殖和稳定的定向分化能力。PDSCs与骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有相似的生物学特征和分化潜能,但较BMSCs具有更强的成骨分化能力,植入体内后能很好地适应受区环境,并保持良好的成骨活性,最终通过软骨化骨修复骨缺损。现研究证明：骨膜来源干细胞已经成为理想的种子细胞来源,是当前骨科临床基础研究的热点。最近出现的可注射性水凝胶支架羟基苯丙酸凝胶(Gelatin-Hpa),它凝固的硬度和速度不受聚合物前体浓度的影响,交联酶(HRP)和氧化剂(H202)的浓度可以分别控制水凝胶的交联速度和程度。目前该可注射性水凝胶已经成为组织工程领域应用中的新兴支架材料。血小板衍生生长因子(PDGF)是由多种细胞产生的重要多肽生长因子,它是多种细胞的有丝分裂刺激原,对间充质于细胞,成骨细胞,成纤维细胞、内皮细胞等均具有趋化作用,是趋化作用最强的骨生长因子。而PDGF-bb是在骨科基础与临床研究领域应用最广泛的变异体之一。PDGF-bb能促进成骨细胞DNA合成,细胞复制,胶原及非胶原蛋白的合成；PDGF-bb能促进血管内皮的增殖,诱导VEGF mRN A的表达,能够促进损伤局部血液循环的重建；对BMP-2研究已经很深入,它是一种能够启动成骨分化,并作用与整个成骨过程的细胞因子,已经广泛应用于骨组织工程中。虽然研究已经表明PDSCs具有修复骨缺损的作用,但应用非诱导的PDSCs进行骨缺损修复的研究不够明确；同时由于骨膜来源干细胞初始数量不足,需要强有力的细胞刺激因子来促进细胞的增殖和成骨分化；基于PDGF-bb和BMP-2各自独特的生理作用,本实验拟应用PDGF-bb联合BMP-2共同作用于骨膜来源干细胞；目前尚没有应用PDGF-bb联合BMP-2对骨膜来源干细胞在二维培养和可注射性水凝胶Gelatin-Hpa中增殖及成骨分化能力影响的研究；待完成本实验后,期待在动物实验中通过简单的注射添加有双重生长因子PDGF-bb和BMP-2以及骨膜来源干细胞的可注射性水凝胶Gelatin-Hpa促进局部隧道内腱骨愈合,最终应用于临床实践。骨膜来源干细胞应用到局部来促进腱骨愈合有以下几个问题：(1)目前没有明确的定义来明确骨膜细胞,更确切的表达应该是骨膜来源干细胞,其各向分化潜能及有效率目前还在进一步研究之中,(2)由于骨膜来源干细胞只存在骨膜的最里层,含量比较少,需要有一定内外刺激骨膜细胞的增生,同时能促进其向成骨方向分化。(3)骨膜来源干细胞应用到损伤局部需要一定的载体,它能给骨膜来源干细胞的增殖、成骨分化提供一个良好微环境。针对以上骨膜来源干细胞在骨科临床基础研究中遇到的问题本实验分成三个部分：(1)骨膜来源干细胞的分离,二维培养与功能鉴定：取小型猪股骨骨膜,常规原代细胞分离培养,选用STRO-1作为标志物,根据间接免疫磁珠正选法纯化骨膜来源干细胞,相差显微镜观察细胞的形态以及普通扩增培养基下的细胞的生长曲线；然后分别取不同代的骨膜来源干细胞(P3、P5、P7)在成骨培养基的诱导下观察ALP活性、钙盐沉积以及相关成骨基因如ALP, Runx-2, Col-I, OCN基因表达的水平,结果显示P3、P5、P7骨膜来源干细胞具有良好的成骨分化能力,但是随着传代次数的增加,成骨分化能力也相应的减弱,P7各项成骨分化能力指标明显弱于P3(P<0.05)。(2)检测单独PDGF-bb或者联合BMP-2在体外对骨膜来源干细胞的增殖以及成骨分化能力的影响；通过MTT法检测不同浓度PDGF-bb对骨膜来源干细胞增殖能力的影响,结果显示随着PDGF-bb浓度的提高,其对骨膜来源干细胞增殖促进作用也增强,以50ng/ml最为明显,然而随着PDGF-bb浓度进一步提高,其对PDSCs的增殖作用相应的减弱,但不同浓度之间对PDSCs的增殖影响没有统计学差异(P>0.05)。然后分别比较不同实验组之间OM,OM+PDGF-bb、OM+BMP-2、OM+BMP-2+PDGF-bb的成骨分化能力,采用RT-PCR和von-Kossa矿物质沉积染色,结果显示：与单独PDGF-bb或BMP-2作用于骨膜来源干细胞相比, PDGF-bb联合BMP-2对细胞的增殖作用没有显著性差异(P>0.05)；PDGF-bb对BMP-2生长因子在二维培养的情况下对骨膜来源干细胞的成骨分化具有抑制作用。(3)在前两部分的基础上,选用骨膜来源干细胞为种子细胞,选用Gelatin-Hpa为水凝胶支架,单独添加PDGF-bb或添加双重生长因子PDGF-bb和BMP-2,然后检测骨膜来源干细胞在可注射性水凝胶中的生物相容性以及增殖和成骨分化能力,结果显示骨膜来源干细胞在Gelatin-Hpa生物相容性良好,同时发现PDGF-bb联合BMP-2生长因子在可注射性水凝胶三维培养环境中在促进成骨分化方向上具有协同作用。第一部分：骨膜来源干细胞(PDSCs)的分离、培养与鉴定目的：分离和纯化小型猪骨膜来源干细胞,同时检测不同代(P3、P5、P7)骨膜来源干细胞之间的增殖和成骨分化能力的区别。方法：从小型猪股骨取下骨膜块组织从50ml的试管中取出,剪碎并用相应的酶消化,常规原代细胞培养,对骨膜来源干细胞进行SP免疫组织化学染色,然后选用STRO-1作为标志物,根据间接免疫磁珠正选法纯化骨膜来源干细胞；分别取不同代的骨膜来源干细胞(P3、P5、P7)在成骨培养基的诱导下观察ALP活性、钙盐沉积情况以及相关成骨基因如LP、Runx-2、Col-I、OCN基因表达情况。结果：培养3-4天后细胞的形态为多变,有梭形,三角形或多角形；普通扩增培养基下的骨膜来源干细胞呈现典型的细胞生长曲线；骨膜来源干细胞抗STRO-1染色阳性；P3、P5、P7骨膜来源干细胞具有良好的成骨分化能力,但是随着传代的次数的增加,成骨分化能力也相应的减弱,P7各项成骨分化能力指标如ALP活性、钙盐沉积情况以及相关成骨基因如ALP、Runx-2、Col-I、OCN基因表达情况等明显弱于P3(P<0.05)。结论：骨膜细胞因为其比较强的成骨能力及相对简单的培养、诱导条件,使其目前成为骨组织工程实验室研究很有潜力的种子细胞；STRO-1作为标志物,根据间接免疫磁珠正选法纯化骨膜来源干细胞是一种有效的原代细胞纯化方法；考虑到骨膜来源干细胞随着传代次数的增加,其成骨分化能力会相应的减弱,所以在骨组织工程应用中尽量选择P5之前的骨膜来源干细胞。第二部分单独PDGF-bb或者联合BMP-2对骨膜来源干细胞的增殖、成骨分化能力的影响目的：检测单独PDGF-bb或者联合BMP-2在二维培养环境下对骨膜来源干细胞的增殖、成骨分化能力的影响。方法：将浓度分别为10、20、50.100.150ng/ml的PDGF-bb加入96孔培养板中,采用MTT法,检测不同浓度PDGF-bb对骨膜来源干细胞增殖能力的影响；然后选取P3骨膜来源干细胞,采用RT-PCR和von-Kossa染色法,检测PDSCs在含有不同生长因子的培养基中(OM、OM+PDGF-bb、OM+BMP-2OM+BMP-2+PDGF-bb)成骨分化能力。结果：随着PDGF-bb浓度的提高,其对骨膜来源干细胞增殖促进作用也相应的增强,以50ng/ml最为明显,然而随着PDGF-bb浓度进一步提高,其对PDSCs的增殖作用相应的减弱,但不同浓度之间对PDSCs的增殖影响没有统计学差异(P>0.05)。然后分别比较不同实验组之间OM、OM+PDGF-bb、OM+BMP-2、 M+BMP-2+PDGF-bb的成骨分化能力比较,采用RT为-PC R和von-Kossa矿物质沉积染色,与生长因子PDGF-Bb或BMP-2作用于骨膜来源干细胞相比,PDGF-bb联合BMP-2生长因子对细胞的增殖作用没有显著性差异。PDGF_bb对BMP-2生长因子在二维培养的情况下对骨膜来源干细胞的成骨分化具有抑制作用。结论：PDGF-bb对于骨膜来源干细胞的增殖具有很强的促进作用,且呈现浓度依赖型,其中以浓度50ng/ml达到高峰,但是随着浓度PDGF-b b继续增加,促进细胞增殖作用开始下降。与生长因子PDGF-bb或BMP-2作用于骨膜来源干细胞相比,PDGF-bb联合BMP-2生长因子对细胞的增殖作用没有显著性差异。PDGF-bb对BMP-2生长因子在二维培养的情况下对骨膜来源干细胞的成骨分化具有抑制作用。第三部分：载PDGF-bb和BMP-2的可注射性水凝胶Gelatin-Hpa对骨膜来源干细胞增殖及成骨分化能力的影响目的：检测骨膜来源干细胞与可注射性水凝胶Gelatin-Hpa的生物相容性以及载PDGF-bb和BMP-2的可注射性水凝胶Gelatin-Hpa对骨膜来源干细胞增殖及成骨分化能力的影响。方法：首先检测Gelatin-Hpa的流变性能以及体外降解性能,然后观察骨膜来源干细胞种植在可注射性水凝胶Gelatin-Hpa的存活率以及粘附率；同时观察骨膜来源干细胞在不同浓度H202的氧化刺激下的表现；最后采用采用RT-PCR和von-Kossa染色法检测骨膜来源干细胞在含有不同生长因子(OM、OM+PDGF-bb. OM+BMP-2、OM+BMP-2+PDGF-bb)的成骨培养基诱导下的成骨分化相关基因(ALP、Runx-2、Col-1、OCN)的表达水平以及矿盐沉积情况。结果：骨膜来源干细胞在可注射性水凝胶Gelatin-Hpa具有良好的相容性,细胞存活率>90%,细胞粘附率>80%；骨膜来源干细胞在可注射性水凝胶Gelatin-Hpa具有高度耐受氧化的能力,骨膜来源干细胞包埋在Gelatin-Hpa中24小时后给予H202氧化应激,同时胶原作为对照组采用相同的方式。结果显示包埋在胶原中的骨膜来源干细胞更容易受到H202的氧化应激,出现大量的细胞死亡,尤其在H202比较高的时候。相反,在Gelatin-Hpa中的骨膜来源干细胞存活情况则基本不受H202氧化应激的影响。早期成骨分化的基因Col-I、ALP在第7天和14天的mRNA表达水平在OM+BMP-2+PDGF-bb组明显高于其他实验组,尤其是OM+BMP-2+PDGF-bb与OM+BMP-2存在显著性差异(P<0.01),提示PDGF-bb在促进骨膜来源干细胞增生的同时,与BMP-2诱导骨膜细胞向成骨方向分化存在协同作用；这个趋势同样在晚期成骨标志OCN得到体现；这点与骨膜来源干细胞在二维培养中的成骨分化能力表现有所不同。结论：结果显示骨膜来源干细胞在Gelatin-Hpa生物相容性良好,同时发现PDGF-bb联合BMP-2生长因子在可注射性水凝胶三维培养环境中在促进成骨分化方向上具有协同作用。