论文部分内容阅读
目的:脂肪生成是指前脂肪细胞通过不同的机制转化为脂肪细胞。最新研究表明,脂肪细胞分化障碍和脂肪生成因子的减少是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)代谢紊乱的重要原因。脂肪细胞分化成为近年来的研究热点,脂肪细胞分化障碍会导致FFA储存不足,导致血浆中FFA水平升高,导致肝脏和肌肉脂肪沉积增加,最终导致胰岛素抵抗和T2DM。胰高血糖素样肽1(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)是一种由下消化道的L型内分泌细胞分泌的一种促胰岛素激素。GLP-1及其类似物GLP-1受体激动剂可通过调控PKB/C和Wnt等信号通路,促进脂肪细胞分化。然而,GLP-1调控脂肪分化的分子作用机制远未阐明。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一种转录长度超过200 nt的内源性RNA分子。最近的研究表明,lncRNAs水平的失调与包括糖尿病在内的多种人类疾病有关。然而,lncRNAs是否参与脂肪细胞分化尚不清楚。所以本课题主要从lncRNAs角度阐明GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞诱导成脂分化过程调控的分子作用机制。方法:1.体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在诱导成脂分化过程中,使用不同浓度的GLP-1(0、50、100、200、500n M)进行处理。PCR和Western Blotting实验观察GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞增殖和成脂分化水平的影响。通过GEO数据库在线查找GLP-1影响的LncRNAs表达谱,发现lncRNA PFAR的表达水平发现显著改变,通过real-time PCR检测GLP-1浓度梯度刺激后对3T3-L1细胞中LncRNA PFAR表达水平的影响。2.通过RNAi技术,设计LncRNA PFAR的特异性siRNA,转染3T3-L1细胞后,观察3T3-L1细胞增殖和成脂分化水平。通过生物信息学分析,荧光素酶报告实验,RNA Pull Down和AGO2 RNA免疫共沉淀实验,筛选LncRNA PFAR吸附的miR-138以及miR-138靶向抑制的mRNA YAP1。通过转染miR-138 mimic和YAP1 siRNA,进一步验证LncRNA PFAR-miR-138-YAP1对3T3-L1细胞增殖和成脂分化水平的影响。3.用高脂饮食喂养小鼠8周诱导肥胖模型,同时给予GLP-1受体激动剂Liraglutide和YAP1-TEAD信号通路抑制剂Verteporfin,检测血糖、血脂等相关生化指标,采用苏木精-伊红(H&E)染色方法对各组小鼠的脂肪组织进行石蜡切片染色,检测各组小鼠脂肪组织脂肪分化及合成关键因子的表达量。结果:1.GLP-1浓度依赖性抑制3T3-L1细胞的增殖水平,促进成脂分化,上调成脂分化及合成关键基因的mRNA和蛋白表达水平。GLP-1浓度依赖性上调3T3-L1细胞中LncRNA PFAR的表达水平。2.LncRNA PFAR可以靶向序列特异性结合miR-138。miR-138过表达显著减弱GLP-1对3T3-L1细胞增殖水平的抑制作用和成脂分化的促进作用,并且显著下调3T3-L1细胞成脂分化及合成关键基因的mRNA和蛋白表达水平。miR-138可以靶向结合YAP1 mRNA的3’UTR序列,抑制YAP1的表达。YAP1基因干扰显著减弱GLP-1对3T3-L1细胞增殖水平的抑制作用和成脂分化的促进作用,并且显著下调3T3-L1细胞成脂分化及合成关键基因的mRNA和蛋白表达水平。3.动物体内实验中,高脂饮食组体重增加、Lee’s指数变大、脂肪重量增加、脂肪细胞体积变大、糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗。而使用GLP-1受体激动剂Liraglutide处理后,能够有效抑制高脂饮食鼠肥胖的发生,同时降低血糖、甘油三酯、游离脂肪酸等糖脂代谢生化指标,抑制肥胖诱导的细胞横截面面积增大,并且能有效抑制脂肪分化及合成关键因子的表达。YAP1-TEAD信号通路被抑制后,Liraglutide对小鼠肥胖的抑制作用完全被逆转,糖脂代谢生化指标、细胞横截面面积及脂肪分化及合成关键因子表达均升高至与肥胖小鼠相当。结论:1.本研究发现GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的促进作用依赖于LncRNA PFAR。2.LncRNA PFAR可以靶向结合miR-138,解除miR-138对YAP1 mRNA的抑制作用,进而上调YAP1的表达,激活YAP1-TEAD信号通路。这些发现,从lncRNA角度揭示了GLP-1对3T3-L1前脂肪细脂肪成脂化的调控作用,将有助于为GLP-1受体激动剂类药物在代谢性疾病中应用,提供新的思路。