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研究背景帕金森病(Parkinson’ s Disease,PD)是一种发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的慢性神经退行性疾病,以中脑黑质多巴胺能神经元变性、丢失为主要病理改变,导致纹状体内多巴胺水平降低。临床主要表现为静息性震颤、肌僵直、动作缓慢等运动障碍症状。PD的病因尚未完全清楚,目前普遍认为PD可能是遗传、环境和老龄化等因素共同作用的结果。已发现线粒体形态异常、功能障碍及动力学失衡等改变与PD的发病机制密切相关。Parkin是帕金森病的遗传易感基因,突变后可导致PD,且与散发性PD亦有密切关系,其对线粒体形态和功能的影响已成为研究热点之一。目前尚无有效的根治PD的方法,西药多选用多巴胺替代疗法等治疗,但长期服用,会出现诸多毒副反应。传统中医药因其独特理论体系和整体观念,在改善PD临床症状方面,具有一定的疗效和优势。大补阴丸(DBYW)和牵正散(QZS)是临床治疗PD的常用方,课题组前期研究已经证实了 DBYW和QZS在一定程度上可以调控PD动物模型脑线粒体基因等的表达,在一定程度上改善PD动物模型的症状、保护中脑多巴胺神经元的功能,且二者合方效果更佳。在此研究基础上,本实验以Parkin基因为切入点,进一步从细胞、分子水平研究两方合用的作用环节和机制。研究目的本研究建立了MPP+诱导的SH-SY5Y细胞PD模型,探究中药合方对PD模型细胞线粒体形态和功能的影响以及与PINK1/Parkin通路的相关性,进而通过将Parkin基因过表达质粒转染SH-SY5Y细胞,从Parkin基因的调控角度进一步探讨中药合方对PD细胞模型线粒体质量影响的分子机制,为临床应用DBYW合QZS治疗PD提供科学依据,也为中医合方理论提供实验依据和科学内涵,为中药复方进一步利用奠定基础。研究方法实验一大补阴丸合牵正散对PD细胞模型线粒体及PINK1/Parkin表达的影响:培养SH-SY5Y细胞、MPP+造模并中药干预,实验分3组:①正常对照组;②模型组;③中药治疗组。指标检测:①CCK-8法检测细胞存活率;②用线粒体探针MitoTracker(?)Red CMXRos标记、激光共聚焦显微镜观察线粒体形态及活性;③线粒体探针—TMRM检测线粒体膜电位;④荧光素酶法检测ATP水平;⑤免疫荧光化学法检测PINK1、Parkin蛋白的表达;⑥免疫荧光三标技术检测Parkin蛋白与PINK1蛋白与线粒体(T0M20)的定位关系。实验二Parkin基因过表达细胞模型的构建:构建Parkin基因过表达质粒,培养SH-SY5Y细胞并转染,实验分3组:①正常对照组;②阴性对照组;③Park.n过表达组。指标检测:①荧光显微镜观察SH-SY5Y细胞转染情况;②RT-PCR检测Parkin mRNA的表达;③Western Blot技术检测Parkin蛋白的表达。实验三大补阴丸合牵正散对Parkin基因过表达PD细胞模型线粒体质量的影响:在构建Parki.n基因过表达质粒、培养SH-SY5Y细胞并转染的基础上,进行MPP+造模及中药干预,实验分6组:①阴性对照组;②阴性模型组;③阴性治疗组;④Parkin对照组;⑤Parkin模型组;⑥Parki.n治疗组。指标检测:①CCK-8法检测各组细胞存活率;②mitoTracker(?)Red CMXRos探针标记线粒体、激光共聚焦显微镜观察其形态及活性;③线粒体探针TMRM检测线粒体膜电位;④荧光素酶法检测细胞ATP水平;⑤免疫荧光化学法检测细胞PINK1、Parkin蛋白表达水平;⑥免疫荧光三标技术检测细胞Parkin蛋白和PINK1蛋白与线粒体(T0M20)的共定位关系;⑦Western-Blot技术检测与线粒体质量重塑密切相关的融合蛋白1(Mfn1)、2(Mfn2)以及与分裂相关的动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)的表达水平。研究结果实验一结果:1.细胞存活率及线粒体形态的变化:与正常对照组相比,PD模型组细胞存活率明显下降(P<0.01),线粒体网格减少,碎片增多,形态因子及活性均显著降低(P<0.05);而与模型组相比,中药治疗组的细胞存活率显著提高(P<0.01),线粒体形态因子和活性明显增加(P<0.05)。2.线粒体功能的变化:与正常对照组相比,其余两组线粒体膜电位(△ Ψm)(P<0.01)和ATP水平均显著降低(P<0.05);与模型组比较,中药治疗组细胞△ Ψm明显升高(P<0.01),而ATP水平增加不明显。3.PINK1和Parkin蛋白的表达:与正常对照组相比,造模后PINK1、Parkin蛋白相对荧光强度均明显降低(P<0.01),表达减少,而中药组可以显著增加PINK1和Parkin蛋白的表达水平(P<0.01)。4.Parkin蛋白与PINK1蛋白的线粒体定位:与正常对照组相比,模型组细胞PINK1与 T0M20(P<0.05)、PINK1 与 Parkin(P<0.01)以及 Parkin 与 T0M20(P<0.05)的共定位系数均显著降低,而中药治疗后Parkin、PINK1与T0M20三者间的共定位系数均显著增加(P<0.05)。实验二结果:Parkin过表达质粒提取之后,与正常对照组相比,转染组可观测到较多的绿色荧光蛋白表达;与正常对照组和阴性对照组相比,Parkin过表达组SH-SY5Y细胞内的Parkin mRNA和蛋白的表达均显著提高(P<0.01)。实验三结果:1.细胞存活率及线粒体形态的变化:与阴性对照组相比,Parkin过表达对照组细胞存活率明显增加(P<0.05),阴性模型组细胞和Parkin模型组细胞存活率及线粒体活性均明显下降(P<0.01);与阴性模型组比较,阴性治疗组细胞存活率(P<0.01)、线粒体形态因子(P<0.05)及活性(P<0.01)均显著增高;与Parkin对照组相比,Parkin模型组细胞存活率(P<0.01)、线粒体形态因子(P<0.05)和活性(P<0.01)均明显降低;而与Parkin模型组比较,Parkin治疗组细胞存活率、线粒体形态因子及活性均明显增加(P<0.01)。2.线粒体功能的变化:与阴性对照组相比,Parkin对照组线粒体△Ψm(P<0.01)和ATP水平(P<0.05)均显著增加,阴性模型组线粒体△Ψm(P<0.01)和ATP水平(P<0.05)均明显降低;与阴性模型组相比,阴性治疗组线粒体△Ψm(P<0.01)和ATP水平(P<0.05)均明显增加;与Parkin对照组相比,Parkin模型组△Ψm(P<0.01)和ATP水平(P<0.05)明显降低;DBYW合QZS干预后,Parkin治疗组较Parkin模型组和阴性治疗组可明显增加△Ψm(P<0.01)和ATP水平(P<0.05)。3.PINKI和Parkin蛋白的表达:与阴性对照组和Parkin对照组相比,阴性模型组和Parki.n模型组中PINK1和Parkin蛋白的荧光表达均明显降低(P<0.01),且Parkin模型组较阴性模型组两个蛋白的表达水平均显著增加(P<0.01);给予DBYW合QZS处理后,阴性治疗组和Parkin治疗组中PINK1和Parkin的表达显著提高(P<0.01),其中Parkin治疗组PINK1蛋白表达较Parkin模型组虽有增加的趋势,但无统计学差异。4.PINK1蛋白与Parkin蛋白的线粒体定位:与Parkin模型组相比,Parkin治疗组中PINK1与Parkin的共定位系数明显提高(P<0.05),其余各组间差异不明显。5.线粒体相关分裂蛋白和融合蛋白的表达:与阴性对照组和Parkin对照组比较,阴性模型组和Parkin模型组细胞线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1(P<0.05)以及融合蛋白Mfn1(P<0.01)、Mfn2的表达水平均有所下降;与阴性模型组相比,阴性治疗组的Fis1、Mfn2蛋白表达水平明显提高(P<0.05);与Parkin模型组相比,Parkin治疗组的Mfn2的表达水平有显著提高(P<0.05),其余各组差异不明显。结论1.DBYW合QZS对MPP+所造成的SH-SY5Y细胞损伤具有一定的保护作用,能改善MPP+对线粒体形态的损伤,维持线粒体网状结构、改善线粒体膜电位,但对ATP的合成无明显作用,其机制可能与PINK1/Parkin通路调节有关。2.通过脂质体转导技术,应用Lipo3000转染试剂将Parkin过表达质粒转染入SH-SY5Y细胞,可成功构建Parkin基因过表达的细胞模型,为进一步实验奠定了基础。3.Parkin基因过表达可明显提高正常SH-SY5Y细胞活性,改善线粒体的形态和功能,对MPP+所造成的SH-SY5Y细胞和线粒体损伤也有一定的保护作用,尤其是能明显提高线粒体的活性和膜电位。4.中药DBYW合QZS能提高Parkin基因过表达对MPP+诱导的细胞和线粒体损害的保护作用,其机制可能是通过促进PINK1募集Parkin于线粒体以及调节线粒体分裂蛋白和融合蛋白的动态平衡来维持线粒体的质量。