1、背景和目的肿瘤热疗是指采取各种加热方式提高全身和(或)肿瘤组织(局部)的温度,利用热作用及其继发效应来治疗恶性肿瘤的方法。热疗应用于肿瘤治疗已有上百年历史,建立在现代科学基础上的肿瘤热疗学始于20世纪60年代初,之后取得了许多突破性的进展。大量的体外实验和临床资料显示,肿瘤热疗虽然不能取代手术、化疗或放疗作为一种独立的肿瘤治疗手段,但它对化疗、放疗和手术等肿瘤治疗手段具有明显的增效和补充作用。正因为如此,肿瘤热疗近年来发展迅速,成为继手术、放疗、化疗和生物治疗之后又一重要的肿瘤治疗手段。1996年德国学者Gordon等提出磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia,MFH)新技术后,热疗再次成为肿瘤治疗领域的研究热点。随着对热疗治疗肿瘤机制研究的不断深入,人们逐渐能从细胞水平和分子生物学水平认识到热作用对癌细胞结构、功能和生长代谢所造成的影响,从而对热效应治疗肿瘤的现象作出科学的解释。肿瘤热疗分为温热疗法(40-42℃)、高热疗法(43-47℃)、热消融疗法(>47℃)。温热疗法所需热作用时间较长,患者不易耐受长时间的热处理,故临床应用较少；热消融治疗对肿瘤病灶的体积及位置要求较高,并且热消融对肿瘤组织及其周围正常组织可造成无差异的凝固性坏死,其临床应用亦受到限制；故目前临床应用及实验研究较多的为高热疗法,由于肿瘤与正常组织微循环的差异,此热处理可在不伤害正常细胞的情况下“特异性”杀伤肿瘤细胞；其作用机制主要有以下几点；1、直接杀伤作用,其理论依据是实验发现热处理后肿瘤细胞的各种生物膜以及细胞骨架受到了破坏进而影响其流动性及渗透性；热处理还可破坏细胞内的多种蛋白进而影响DNA的复制、转录、表达等活动,最终导致细胞死亡。2、诱导凋亡作用,研究发现热损伤后细胞内caspase-3等促进细胞凋亡相关基因表达增强,survivin等凋亡抑制基因的表达降低；最后通过线粒体途径或死亡受体途径促进肿瘤细胞凋亡。3、抑制侵袭、转移作用,肿瘤组织加热后降解细胞外基质的蛋白水解酶显著减少,而E-钙粘素等细胞间粘附分子明显增多,此两者可降低肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。4、提高机体免疫作用,肿瘤的发生、发展与机体免疫状态密切相关,文献报道热疗后IL-6、CD4、CD57等体液免疫因子在肿瘤病灶大量分布,产生此类细胞因子的单核巨噬细胞及T、B细胞也聚集于此,从而印证了热疗可提高机体体液及细胞免疫功能达到抗肿瘤目的。由于缺乏有效的热传递及热探测技术,临床上热疗常与放疗联用。其联用机制之一是放、热疗具有周期互补作用：放疗抵抗的S期细胞对热疗敏感；热疗增敏放疗疗效的另一机制是热疗可抑制放疗后DNA双链断裂(DNA double strands break,DSB)的修复。有研究者猜想热疗是否亦可导致DSB,目前的研究结果显示热疗可以在非S期细胞内形成DSB,S期细胞不能或仅形成少量的DSB。众所周知,DSB是最严重的DNA损伤,研究报道细胞内存在一个DSB未修复即可导致细胞死亡。故热损伤后S期细胞内无DSB形成与S期细胞热敏感是相矛盾的。由于肿瘤细胞的增殖能力远远大于正常细胞,即肿瘤组织内处于复制状态的细胞比例远远高于正常组织,所以明确S期细胞热敏感的机制对于肿瘤的治疗具有重大的意义。本研究重点探讨S期细胞热损伤后是否形成DSB,并结合DNA复制、复制后修复(Post Replication Repair,PRR)途径中的跨损伤合成(translesion synthesis)通路等分析热损伤后DSB形成的可能机制；旨在为热疗的临床应用提供更多的理论基础,使热疗在肿瘤临床治疗中的单独应用得到推广。2、方法(1)H1299细胞45℃孵箱加热所需时间及S期同步条件的探索本研究加热温度选择进行高热治疗的中间温度45℃,加热时间采用平板克隆形成实验确定：取对数生长期的H1299细胞重新铺板并培养24h待细胞贴壁牢固后用45℃预热的孵箱按实验分组分别热处理Oh、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h,之后恢复正常温度继续培养14天,最后染色、计数、分析实验结果。因克隆形成率太高说明热损伤可能未形成,克隆形成率太低不能保证后续实验的顺利进行,所以取克隆形成率接近50%的加热时间为本研究最终采用的热处理时间。为探讨S期细胞热损伤敏感的原因,研究采用血清饥饿法将H1299细胞同步至S期,饥饿时间参考文献报道的28h,然后采用流式细胞术确定H1299细胞无血清培养后还需继续正常培养多少时间达到S期同步效果最大化。(2)S期H1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成及其对细胞存活能力的影响按照上述实验获得的S期同步条件及热损伤条件获得同步至S期的H1299细胞进行热处理,再根据实验分组收集细胞应用中性单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)实验动态检测热损伤后不同时间点细胞内的“彗星拖尾”情况并用CASP软件定量分析DNA双链断裂程度。最后用台盼蓝拒染实验检测S期H1299细胞热损伤后的存活率,结合中性单细胞凝胶电泳实验及台盼蓝拒染实验的结果分析DNA双链断裂与细胞死亡的关系。(3)H1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成的可能机制综合分析目前已发表的研究成果,我们推测热损伤后S期细胞内DNA双链断裂形成的可能机制为细胞受热后形成的某些DNA碱基损伤在未得以修复的情况下使周期阻滞在S期并继续指导复制进而形成DSB。因S期细胞内DNA损伤主要由复制后修复途径修复,于是我们利用蛋白免疫印迹实验(Western blot,WB)检测H1299细胞热损伤后细胞核内复制后修复途径跨损伤合成通路中的相关蛋白与DNA的结合情况(如Rad18及其下游ub-PCNA蛋白)判断复制后修复途径是否受抑,并用流式细胞术动态观察热损伤后细胞周期变化情况再结合S期阻滞相关蛋白p-ATM与DNA的结合情况以及EdU掺入实验分析热损伤后是否发生了S期阻滞以及阻滞期间DNA复制是否仍在进行。3、结果(1)H1299细胞45℃孵箱加热所需时间及S期同步条件的探索H1299细胞经45℃孵箱热处理0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h后克隆形成率分别为100%、67.87%、43.73%、30.09%、21.29%、7.79%,由此可知45℃孵箱加热1h为H1299细胞热损伤形成的较好条件。将H1299细胞进行无血清培养28h后恢复10%胎牛血清继续培养,收集不同时间点的细胞利用流式细胞术检测细胞周期的结果显示饥饿培养28h后恢复完全培养基继续培养18h可有效使细胞同步至S期,其比例可达69.27%±0.81%；而未经饥饿的细胞S期比例持续在27.24%Q1.75%的低水平。(2)S期H1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成及其对细胞存活的影响按照上述探索的周期同步条件及热损伤条件得到S期H1299细胞后进行热损伤(45℃×1h)处理,然后应用中性SCGE实验动态检测热损伤后不同时间点细胞内DNA双链断裂程度,结果提示S期H1299细胞热损伤后即刻至2.5h前均无明显的“彗星拖尾”现象,其Olive尾力矩(Olive Tail Moment,OTM值)与对照组亦无统计学差异；热损伤后5h开始出现明显的“慧星拖尾”现象(OTM值与对照组有统计学差异,P<0.05)。台盼蓝拒染实验分析S期H1299细胞热损伤后细胞死亡率的结果显示S期细胞热损伤后7.5h内死亡率保持较低水平(与对照组无统计学意义),7.5h后死亡细胞急剧增多,至12.5h时细胞死亡率达78.72%±2.07%。(3)H1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成的可能机制Western Blot结果显示H1299细胞经热损伤后细胞核内与DNA结合的参与DNA损伤复制后修复途径的Rad18蛋白较未加热组显著减少,并随着热损伤后恢复正常培养时间的延长呈逐渐降低的趋势；其下游蛋白ub-PCNA较未加热组亦减少,但呈先降后升的趋势。感受DNA损伤并激活细胞周期检查位点通路的p-ATM蛋白在未加热组细胞内与DNA无结合,而加热组细胞内与DNA结合的p-ATM随着热损伤后恢复正常培养时间延长逐渐增高直至观察到第5h时表达量达到最多,之后又减少至消失。热处理并恢复正常培养多个时间点后收集细胞应用流式细胞术动态检测细胞周期分布的结果显示热损伤的H1299细胞随着恢复正常培养时间的延长,S期细胞比例首先呈上升趋势并于热处理后7.5h达到最高值(51.63%±0.27%,与未加热组细胞有统计学差异,P<0.01),随后S期比例逐渐下降。加热组GO/G1、G2/M期比例变化随着S期比例变化此起彼伏,未加热组细胞各周期比例变化较小。EdU掺入实验显示未同步的H1299细胞热损伤后DNA复制率先升后降,7.5h达到峰值(44.48±1.23%,与对照组差异有统计学意义,P<0.01)；7.5h后DNA复制率开始降低。4、结论(1)非小细胞肺癌H1299细胞45℃×1h热损伤后可致S期阻滞并延迟性形成DNA双链断裂。(2)本研究条件下的热损伤可致复制后修复途径中的重要蛋白Rad18及ub-PCNA明显受抑。(3)S期H1299细胞45℃×1h热损伤后DSB延迟形成的可能机制为复制后修复通路抑制的同时复制继续,使碱基损伤演变为DSB。5、本研究的创新之处(1)本研究首次发现S期细胞热损伤后可形成DNA双链断裂,但具有延迟性特点；并对DSB延迟形成的机制做了进一步研究。(2)本研究首次发现热损伤可使Rad18及ub-PCNA与DNA结合减少从而抑制复制后修复途径中跨损伤合成通路。(3)本研究部分首次探索了S期细胞热损伤后DSB形成的可能机制,可为肿瘤热疗的临床独立应用奠定一定的理论基础。