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泥螺足我国东部沿海重要的滩涂经济贝类。本研究收集了我困杭州湾附近地区6个泥螺野生群体及江浙地区8个泥螺野生群体。用磁珠富集法分离获得泥螺的微卫星标记,并将这些标记用于上述泥螺群体的遗传多样性和系统进化研究,以期为我国泥螺种质资源挖掘、保护和创新利用提供重要的理论基础。主要包括下列内容:
1.泥螺微卫星的开发
采用生物素-磁珠吸附微卫星富集法,分离泥螺的微卫星分子标记。经MseⅠ内切酶酶切后选取200-500bp大小的片段,采用(CA)15为探针,与pGEM-T载体连接后转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a感受态细胞。结果在筛选的111白色菌落中,经测序共获得微卫星序列68个,阳性克隆率为61.3%。其中完美型占42.7%,非完美型38.2%,复合型占19.1%。除探针中使用的CA重复外,还得到TG、AG、TAG、GTT、TCTG、AAAG、CTGG等的重复序列。本实验所获得的泥螺微卫星序列重复数在10次以上的占总数的87.3%,最多重复次数为64次。用在线引物设计软件Primer3设计引物52对,挑选其中的25对合成,得到14对能扩增出多态性片段的微卫星引物。
2.杭州湾地区泥螺群体遗传多样性的研究
采集了我困杭州湾附近地区共6个群体:上海市崇明县港沿镇群体(SCG)、上海市浦东新区芦潮港群体(SPL)、上海市金山区山阳镇群体(SJS)、浙江省平湖市乍浦镇群体(ZPZ)、浙江省慈溪市庵东镇群体(ZCA)、浙江省慈溪市闸塘十浦龙镇群体(ZCZ)。
用8对微卫星引物对这6个群体的遗传多样性和遗传结构进行分析。结果表明:各群体平均观测杂合度Ho介于0.7617-0.8684之间,平均期望杂合度He介于0.8574-0.8861之间,可见6个群体的遗传多样性水平较高,群体间不具有明显差异。突变-漂移平衡分析表明,杭州湾附近地区泥螺野生群体显著具有杂合过剩的位点,这表明杭州湾附近地区泥螺野生群体己偏离了突变-漂移平衡,近期经历了瓶颈效应,野生群体数量曾经下降。AMOVA分析结果显示,遗传变异的88.15%来自于个体内,9.65%来自于群体内个体间,而只有2.20%的遗传差异来自于群体间,说明遗传分化主要来自于个体之间。群体间遗传分化系数位于0.0057-0.0399之间,且不同群体间遗传分化不显著。
3.我国主产区-江浙地区泥螺群体遗传多样性的分析
采集了我国江浙地区共8个群体:浙江省温州市苍南县群体(ZWC)、浙江省温州乐清翁垟镇群体(ZWY)、浙江省台州温岭坞根镇群体(ZTW)、浙江省玉环县清港镇群体(ZYQ)、江苏省东台市弶港镇群体(JDJ)、江苏省大丰市王港滩群体(JDW)、江苏省如东县长沙镇群体(JRC)、江苏省启东市吕四港群体(JQL)。
用8对微卫星引物对这8个群体的遗传多样性和遗传结构进行分析。结果表明:各群体平均观测杂合度Ho介于0.7956-0.9083之间,平均期望杂合度He介于0.8639-0.8906之间,可见8个群体的遗传多样性水平较高,群体间不具有明显差异。突变-漂移平衡分析表明,江浙地区泥螺野生群体显著具有杂合过剩的位点,这表明江浙地区泥螺野生群体已偏离了突变-漂移平衡,近期经历了瓶颈效应,野生群体数量曾经下降。AMOVA分析结果显示,遗传变异的94.69%来自于个体内,3.09%来自于群体内个体间,丽只有2.23%的遗传差异来自于群体间,说明遗传分化主要来自于个体之间。群体间遗传分化系数位于0.0043-0.0562之间,且不同群体间遗传分化不显著。聚类关系显示,首先JDW和JDJ群体聚在一起,在与JRC群体聚在一起,随后与JQL群体聚在一起,再与ZTW聚在一起;ZWY与ZYQ群体聚在一起;最后与ZWC聚在一起。其聚类关系和地理位置具有一定的相关性。