论文部分内容阅读
第一部分Bafilomycin A1抑制钴纳米颗粒诱导的小鼠巨噬细胞细胞毒性和促炎细胞因子的释放的实验研究目的:研究Bafilomycin A1对钴纳米颗粒（Co NPs）诱导的小鼠巨噬细胞细胞毒性和炎症反应的保护作用。方法:（1）采用不同浓度的Co NPs、Co2+和Bafilomycin A1对RAW264.7细胞进行甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞生存率;（2）通过对照组、Co NPs组、低剂量药物组、高剂量药物组四组MTT分析方法检测细胞生存率比较,评估Bafilomycin A1对Co NPs细胞毒性的抑制作用;（3）采用DAPI对RAW264.7细胞核进行染色,荧光显微镜观察细胞数量的变化;（4）扫描电镜观察各组RAW264.7细胞超微形态学的变化;（5）采用ELISA法检测前炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达情况。结果:（1）Co NPs及Co2+对RAW264.7细胞的细胞毒性效应呈现时间、浓度依赖性;Bafilomycin A1（8n M,16n M）对RAW264.7细胞没有细胞毒性;Co NPs和Co2+细胞毒性的起效浓度分别约为50、400μM;（2）随着Bafilomycin A1作用浓度的增高RAW264.7细胞的细胞毒性逐渐减弱（P<0.05）;（3）荧光显微镜观察随着Bafilomycin A1作用浓度的增高RAW264.7细胞数量逐渐增加;（4）扫描电镜观察显示Co NPs组的RAW264.7细胞伪足基本消失,且细胞明显缩小;随着Bafilomycin A1作用浓度的增高RAW264.7细胞的伪足逐渐增多,且细胞铺展面积逐渐与对照组接近;（5）随着Bafilomycin A1作用浓度的增高炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达逐渐减弱（P<0.05）。结论:Co NPs对RAW264.7细胞的细胞毒性效应强于Co2+;Bafilomycin A1（8n M,16n M）没有细胞毒性。Bafilomycin A1对Co NPs所致RAW264.7细胞的细胞毒性和炎症反应具有保护作用。第二部分Bafilomycin A1抑制钴纳米颗粒诱导的小鼠巨噬细胞向破骨细胞分化的实验研究目的:研究探索Bafilomycin A1对Co NPs诱导的RAW264.7细胞分化的影响。方法:（1）RAW264.7细胞培养第5d,通过倒置相差显微镜观察活体破骨细胞形态改变、TRAP染色、TRAP染色阳性细胞计数,从细胞形态学上来评估Bafilomycin A1抑制Co NPs诱导巨噬细胞向破骨细胞分化的作用;（2）培养第6d通过Real-time PCR检测破骨细胞基因表达从基因水平来评估Bafilomycin A1抑制Co NPs诱导巨噬细胞向破骨细胞分化的作用。结果:（1）培养第5d,通过倒置相差显微镜观察,Co NPs组不规则细胞数量增加,体积增大,多核细胞亦增多,其内的细胞核也增多。随着Bafilomycin A1作用浓度的增加,多核细胞数目逐渐减少,多核细胞体积逐渐变小;通过TRAP染色,Co NPs组有大量TRAP染色阳性的破骨细胞形成,随着Bafilomycin A1作用浓度的增加,TRAP染色阳性的破骨细胞数目逐渐减少（p<0.05）。（2）培养第6d Real-time PCR检测破骨细胞基因TRAP、RANK及Cath-K的表达,所得结果规律性与活体破骨细胞形态改变、TRAP染色结果一致。结论:小鼠RAW 264.7细胞能够被RANKL诱导生成破骨细胞,Co NPs能够加速诱导巨噬细胞向破骨细胞分化,Bafilomycin A1能够抑制Co NPs诱导巨噬细胞向破骨细胞分化的进程,呈剂量依赖性。第三部分Bafilomycin A1对钴纳米颗粒诱导的小鼠巨噬细胞不良生物学效应保护作用的机制研究目的:研究pH值对Co NPs溶解的影响,通过H+-ATPase抑制剂Bafilomycin A1抑制RAW264.7对细胞内的Co NPs溶解的影响、TEM超微结构改变及氧化应激水平的影响,初步探讨Bafilomycin A1对Co NPs所致体内外不良生物学效应保护作用的机制。方法:（1）通过ICP-MS测量Co NPs在不同p H值培养基中释放Co2+的水平;（2）各实验组细胞通过ICP-MS测量及EDX能谱测试,评估Bafilomycin A1抑制细胞内Co NPs溶解作用;（3）利用TEM观察各组RAW 264.7细胞超微结构的改变;（4）收集各组RAW 264.7细胞抽提液,通过GSH/GSSG、SOD、CAT、GPx水平检测,评估Bafilomycin A1抑制细胞内氧化应激的作用。结果:（1）培养基中离子释放呈现时间、p H值依赖关系,各时间点释放的浓度均小于Co2+细胞毒性起效浓度;（2）细胞内Co NPs离子释放呈现时间依赖关系,随着Bafilomycin A1作用浓度的增加,细胞内Co NPs离子释放逐渐减少（P<0.05）;（3）Co NPs组RAW 264.7细胞内溶酶体和滤泡的数目急剧增多,Co NPs被溶酶体吞噬,伴有细胞器消失;随着Bafilomycin A1作用浓度的增高,RAW 264.7细胞内溶酶体和滤泡的数目逐渐减少,同时消失的细胞器再次出现;（4）Co NPs组GSH、SOD、GPx、CAT水平明显降低,随着Bafilomycin A1作用浓度的增高,GSH、SOD、GPx、CAT水平相应升高。结论:Co NPs的溶解度在细胞外环境中很低,在细胞内低p H值环境的溶酶体中更容易溶解释放大量钴离子,从而破坏细胞抗氧化防御机制,引起氧化应激损伤,是Co NPs引起细胞毒性反应、炎症反应及诱导破骨细胞分化等一系列不良生物学反应的根本原因。第四部分Bafilomycin A1抑制钴纳米颗粒诱导的小鼠颅骨周围急性炎症反应和骨溶解作用的实验研究目的:研究Bafilomycin A1对Co NPs诱导的小鼠颅骨周围急性炎症反应和骨溶解作用的影响。方法:（1）建立小鼠颅骨周围急性炎症反应和骨吸收注射模型,各组颅骨周围软组织病理学切片染色观察及炎症细胞计数分析;（2）各组颅骨病理学切片染色观察及骨组织计量学数据测量;（3）各组Micro-CT分析;（4）各组颅骨周围软组织促炎细胞因子的测量。结果:（1）颅骨周围软组织病理学切片染色观察及炎症细胞计数分析结果提示Co NPs组细胞浸润最密集,满视野均是核染成深蓝色巨噬细胞或淋巴细胞,随着Bafilomycin A1作用浓度的增加,炎性细胞浸润数目逐渐减少（p<0.05）。（2）颅骨病理学切片染色观察及骨组织计量学数据测量结果提示Co NPs组的样本可见颅骨骨吸收明显,伴炎性细胞浸润。随着Bafilomycin A1作用浓度的增加,骨吸收破坏范围减小,溶解面积减小,炎性细胞浸润数目逐渐减少。（3）Micro-CT分析结果提示Co NPs组骨吸收明显、随着Bafilomycin A1作用浓度的增加,骨吸收破坏范围减小。随着Bafilomycin A1作用浓度的增加BMD和BMC显著升高（P<0.05）。（4）颅骨周围软组织促炎细胞因子表达结果提示Co NPs组软组织内TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表达量显著增高（P<0.05）。随着Bafilomycin A1的剂量的增加而降低,呈剂量依赖性（P<0.05）。结论:Co NPs可以诱导小鼠颅骨周围产生炎症反应,分泌参与破骨细胞调控的TNF-α,IL-1β和IL-6等炎症性细胞因子,引起颅骨骨吸收。Bafilomycin A1具有抑制Co NPs诱导的小鼠颅骨周围产生炎症反应,抑制颅骨骨吸收的作用,呈剂量效应关系。