【摘 要】
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目的:采用无镁细胞外液诱导SD大鼠原代海马神经元体外痫样放电模型,研究维生素D（Vitamin D,Vit D）对痫样海马神经元中钙敏感受体（Calcium sensingreceptor,Ca SR）的表达和信号通路磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Phosphoinositol3kinase/serine/threonine protein Kinase,PI3k/Akt）的影响,为癫痫
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目的:采用无镁细胞外液诱导SD大鼠原代海马神经元体外痫样放电模型,研究维生素D（Vitamin D,Vit D）对痫样海马神经元中钙敏感受体（Calcium sensingreceptor,Ca SR）的表达和信号通路磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Phosphoinositol3kinase/serine/threonine protein Kinase,PI3k/Akt）的影响,为癫痫的临床药物治疗提供新的思路。方法:选取新生3日龄以内的SD大鼠,无菌条件下进行海马神经元体外提取,体外培养至第10天后,分成7组,分别为正常组、无镁组、无镁+丙戊酸钠组、无镁+Vit D组、无镁+Vit D+NPS2390组、无镁+Vit D+精胺组、无镁+Vit D+LY294002组。于倒置显微镜下观察海马神经元不同培养天数时细胞数量及形态学变化;MTT检测法检测细胞活性变化;TUNEL染色检测细胞存活及凋亡形态学特征;HE染色检测细胞药物干预前后形态学变化;蛋白免疫印迹法（Western-blot,WB）检测海马神经元细胞内Vit D受体（Vitamin D receptor,VDR）、Ca SR、PI3K、PPI3K、Akt、P-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果:倒置显微镜观察显示,海马神经元在体外被培养至第10天时,神经元分化成熟、轴突之间形成密集的神经网络、神经元胞体丰满、折光性强,可被用于实验研究。HE染色显示,经无镁干预后,海马神经元胞体变圆,突触变细变短出现皱缩迹象;无镁+Vit D+精胺组、无镁+Vit D+NPS2390组和无镁+Vit D+LY294002组大量海马神经元发生核固缩、肿胀破裂、突触断裂、突起数目减少。TUNEL染色显示,与无镁组相比,无镁+Vit D组和无镁+丙戊酸钠组细胞凋亡数量减少（P＜0.05）,与无镁+Vit D组相比,无镁+Vit D+精胺组、无镁+Vit D+NPS2390组和无镁+Vit D+LY294002组凋亡细胞显著增多（P＜0.01）。MTT检测发现,与正常组相比,无镁组细胞活性显著降低（P＜0.05）,与无镁组相比,无镁+丙戊酸钠组和无镁+Vit D组细胞活性显著增加,相比无镁+Vit D组,当添加Ca SR受体激动剂、Ca SR受体抑制剂、PI3K/Akt通路抑制剂后,细胞活性降低。蛋白免疫印迹检测发现,与正常组相比,无镁组VDR、Bcl-2表达降低,Bax、Ca SR表达增加;与无镁组相比,无镁+Vit D组和无镁+丙戊酸钠组VDR、Bcl-2表达增加,同时PI3K和Akt的磷酸化水平增加,Bax和Ca SR蛋白表达降低;与无镁+丙戊酸钠组相比,无镁+Vit D组VDR、Pl3k和P-Akt表达降低,Bax、Ca SR表达增加;与无镁+Vit D组相比,无镁+Vit D+精胺组、无镁+Vit D+NPS2390组和无镁+Vit D+LY294002组VDR、Bcl-2表达降低,同时PI3K和Akt的磷酸化水平降低,Bax、Ca SR表达增加。结论:无镁细胞外液可诱导海马神经元损伤,增加海马神经元中Ca SR表达;Vit D可减轻无镁诱导的海马神经元损伤,抑制细胞凋亡,降低Ca SR表达;Vit D可通过调节PI3k/Akt信号通路减轻痫样海马神经元损伤,抑制神经元凋亡,保护神经细胞。
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