论文部分内容阅读
急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)M3 亚型。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)与蒽环类药物联合使用,是新诊断APL患者的标准治疗方案,完全缓解率可达到或超过90%,治愈率接近80%。但仍有部分患者因ATRA耐药的发生而导致治疗最终失败,ATRA耐药成为APL患者诊治过程中需要解决的关键问题之一。多肽免疫原性弱、组织渗透性好和半衰期短等特点是其成为疾病体内诊断及靶向治疗制剂的有利因素,目前人们利用噬菌体展示文库筛选技术(Phage display technology)已获得多种肿瘤的靶向多肽,并成功用于疾病的特异性诊断及治疗。在多肽基础上构建的肽体指由多肽与免疫球蛋白IgG的Fc段铰链区融合而成的蛋白,肽体保持了多肽与靶分子的结合特异性,同时兼具免疫球蛋白的半衰期长及具有细胞毒性、生产简易、易于纯化,已经在生物制药领域,尤其是在抗癌药物领域发挥着重要作用,目前已有许多肽体结构药物处于临床不同阶段研究当中。本实验室前期采用浓度递增间歇诱导法,对急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60进行体外诱导筛选,获得相应耐药细胞株,命名为HL-60R。之后采用基于微流控的噬菌体展示随机肽库筛选技术,以HL-60细胞为负筛细胞、HL-60R细胞为正筛细胞进行全细胞消减筛选,获得了四个能够与HL-60R特异性结合的噬菌体克隆:No.26、No.27、No.5R5、No.5R13,展示的外源十二肽序列分别为:pepNo.27(SPTSSFQVGTFA)、pepNo.26(TLTTHGRLFESN)、pepNo.5R5(WAITKPAPAAHP)、pepNo.5R13(TSTTFKSHLDHH),并初步验证了噬菌体-肽与耐药细胞株的结合特异性。在此基础上,本研究根据噬菌体-肽克隆展示的多肽序列进一步合成了相应荧光标记多肽,验证其细胞结合特异性,并构建相应肽体。获得的主要试验结果如下:1、根据噬菌体-肽克隆No.26、No.27、No.5R5、No.5R13的外源插入序列,委托公司合成相应的荧光标记多肽。为了使人工合成多肽与相应噬菌体多肽保持一致的空间构像,我们在人工合成多肽的羧基端增加GGGSK序列以模拟噬菌体PIII蛋白的游离末端,并于赖氨酸上偶联荧光素5-TAMRA,合成相应的荧光标记试验肽及对照肽(GGGAGGGAGGGAK)。流式细胞术及细胞免疫荧光结果显示,四种试验肽均与HL-60R细胞特异性结合,且与其他肿瘤细胞及人胚肾细胞无结合。竞争抑制试验结果显示,未偶联荧光素的试验肽能够有效竞争相应的荧光标记多肽,进一步证实pepNo.27、pepNo.26、pepNo.5R5、pepNo.5R13的结合特异性。pepNo.5R13与正常人外周血有核细胞不结合,提示其具备临床应用潜能。2、根据pepNo.27、pepNo.26序列,设计并合成两端带有EcoR I和Nco I酶切位点的目的片段,与EcoR I和Nco I双酶切的pFUSE-hIgG2-Fc2质粒连接,转化至DH5 α中,挑取阳性菌落提质粒测序。测序结果显示重组质粒pFUSE-hIgG2-Fc2-26,pFUSE-hIgG2-Fc2-27构建成功,将重组质粒转染至293T细胞进行肽体的真核表达,收取上清,Western blot验证肽体Peptibody-26、Peptibody-27 成功表达。3、生物信息学预测pepNo.27、pepNo.26、pepNo.5R5、pepNo.5R13四个肽段的理化性质及三维空间结构。文献检索白血病耐药相关分子,通过GeneCards数据库明确它们的亚细胞定位以确定候选分子在细胞膜存在表达。利用PepSite2软件预测多肽与它们的对接情况,基于对接P值,候选靶蛋白NCAM与pepNo.5R5有对接可能(P<0.05)。候选靶蛋白P-gp与四种靶向肽均有对接可能,结合可能性分别是pepNo.26(P=0.04336)、pepNo.27(P=0.04421)、pepNo.5R5(P=0.03271)、pepNo.5R13(P=0.02861)。候选靶蛋白 Bcl-2 与 pepNo.26、pepNo.5R5 和 pepNo.5R13具有结合可能,结合可能性分别是pepNo.26(P=0.02514)、pepNo.5R5(P=0.008697)和 pepNo.5R13(P=0.03774)。综上所述,本研究根据前期筛选获得的噬菌体克隆展示外源多肽序列,合成了四个荧光基团5-TAMRA标记的相应多肽。随后细胞免疫荧光结合实验、竞争抑制试验、流式细胞术等多个实验进一步证实了四种多肽与急性早幼粒细胞白血病耐药细胞系HL-60R的结合特异性。同时我们还成功构建了 pepNo.26、pepNo.27的相应肽体并在真核细胞表达。上述研究结果有望可以提供新的ATRA耐药性APL细胞检测及靶向治疗策略,为探索ATRA耐药性APL细胞耐药机制,开发新的ATRA耐药逆转策略提供重要实验基础。