第一部分肾血管性高血压大鼠模型的制备研究背景高血压是一种常见病,多发病,是全球范围内的重大公共卫生问题。高血压可引起身体许多器官产生疾病,其中以脑卒中和心肌梗死最常见,而成为人类致残或死亡的主要危险因素。长期以来,许多学者致力于高血压的病因及发病机制研究,建立适当的动物模型是开展这一研究的重要工具。形成肾动脉高血压大鼠的方法,通常用银夹在肾动脉上,一般是狭窄左肾动脉保留右肾即“两肾一夹”型(two-kidney one clip,2K1C)。这是经典的制备高血压模型的方法,其操作简便,成功率高,应用广泛。此类方法可应用的动物包括大鼠、小鼠、兔子、狗、猪、猴等。肾性高血压在高血压的发病中占有相当比例,因此动物肾动脉狭窄制备出的高血压模型,为临床研究高血压的发病机制、药物研发奠定了一定基础。但银夹压迫肾动脉模型较难成功,且银夹材料较难获得。本实验通过改进的采用银针与丝线狭窄肾动脉的方法,制备肾血管性高血压大鼠模型并获得成功。研究方法将SD大鼠随机分为两组：假手术组和手术组。手术组采用银针与手术缝线狭窄大鼠左肾动脉,形成2K1C肾血管性高血压模型。比较两组大鼠手术前、手术后血压情况。研究结果2K1C高血压大鼠模型在7d内收缩压、舒张压升高,14d高血压已初步形成,21d趋于稳定,并持续在高水平。手术组与假手术组间收缩压、舒张压比较差异有统计学意义(P<0.05)。手术成功率为86.7%。结论采用银针与手术缝线狭窄肾动脉形成2K1C肾血管性高血压模型,可以在一般的实验室条件下建立并有较高的成功率,符合高血压实验研究的需要。第二部分血管周围脂肪组织在肾血管性高血压中的作用研究背景血管周围脂肪组织(perivascular adipose tissue, PVAT)是围绕在血管周围的一层组织,主要由脂肪细胞组成。PVAT的研究往往与代谢综合征联系在一起,身体脂肪数量的增多或减少都会引起PVAT功能改变,引起2型糖尿病或高血压。已有研究发现自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR)的肠系膜动脉PVAT与正常血压的WKY大鼠相比,SHR的血管周围脂肪数量等同于或少于WKY大鼠的脂肪数量,而且形态上SHR的PVAT脂肪细胞体积小于正常大鼠PVAT的脂肪细胞体积。PVAT调节血管功能不仅在胸主动脉这样的大动脉,而且也在对产生外周阻力作用更大的小动脉上。可见,PVAT与高血压也有着密切的联系。但PVAT功能的改变到底是高血压的原因还是高血压引起的结果尚不清楚,而且PVAT中脂肪细胞的功能改变及形态改变是否与高血压水平一致亦尚未明确。因为PVAT对动脉的血管张力维持起着一定作用,而我们推测PVAT可能在高血压发生初期形态上或功能上发生改变,处于动态的平衡被打破后从而引起血管张力增加,致使血压水平持续上升。本实验通过建立2K1C大鼠高血压模型,初步检测PVAT形态、功能的改变,从而为PVAT与高血压相关性病的研究奠定实验基础。研究方法用2K1C建立肾性高血压大鼠模型(同第一部份2K1C),将20只SD大鼠随机均分为假手术组(SH)和肾性高血压组(RH),术前及术后8周末检测大鼠尾动脉血压、心率,术后8周检测动脉环不带血管外周脂肪组织的裸血管环[F(-)]和保留血管外周脂肪组织的血管环[F(+)]对苯肾上腺素(PHE)及乙酰胆碱(Ach)的反应性；免疫组化法检测一氧化氮合成酶(NOS)的表达；光镜下观察PVAT中脂肪细胞和血管结构,并计算脂肪细胞的体积、胸主动脉中层壁厚(MT)、血管内径(LD)及MT/LD。研究结果SH组和RH组中带有脂肪的胸主动脉对PHE的收缩力同无脂肪的胸主动脉对PHE的收缩力相比较,带有脂肪的动脉较无脂肪的动脉对PHE的收缩反应下降(P<0.05),而SH组对Ach的舒张反应,在浓度为10-5mol/L和10-4mo1/L上,F(+)和F(-)差异有统计学意义(P<0.05),F(+)舒张反应性较F(-)高；RH组只有在10-4mol/L浓度上,F(+)较F(-)舒张反应性高(P<0.05)。RH组的血管NOS表达较SH组降低。PVAT中脂肪细胞形态与大小、两组的动脉结构无明显区别。结论PVAT对血管舒缩有调节功能；在RH组血管周围脂肪组织这种调节作用减弱；PVAT可能成为干预高血压的新靶点。第三部分血管周围脂肪组织在肾血管性高血压血管重构中的作用研究背景随着高血压的深入研究,证实高血压及其并发症的发生发展与血管重构密切相关。高血压过程中血管重构的类型、特点以及发生机制成为高血压研究领域的热点之一。PVAT可能对于血管结构的维持起到一定作用,因为PVAT产生的许多分子影响了平滑肌细胞的增殖、游走。肾素血管紧张素系统(RAS),是一个重要的机体血压及水电解质平衡调节系统,在高血压发生发展中具有重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的重要生物活性物质,它是一系列酶促生化反应的产物。除循环RAS外,局部组织如心脏、血管壁、脑、肾等也能有效地生成Ang Ⅱ,具有独立的RAS系统。PVAT即为一个局部的RAS。因为PVAT中的脂肪细胞富含有血管紧张素原及生产AngⅡ的所有酶,因此PVAT可产生AngⅡ。我们第一部分的研究证实PVAT与高血压的发生、发展相关。因此,PVAT有可能通过RAS参与高血压的血管重构。本实验诣在高血压大鼠PVAT中,观察RAS各相关成分的表达与动脉重构的相关性。研究方法用2K1C建立肾性高血压大鼠模型,将30只SD大鼠随机均分为假手术组(SH)和肾性高血压组(RH),术前及术后12周末检测大鼠尾动脉血压、心率。放射免疫法检测脂肪组织AngⅡ水平。采用实时荧光定量PCR检测血管紧张素原(AGT)和血管紧张素酶(ACE) mRNA表达。采用western blot检测血管紧张素受体1(AT1)和受体2(AT2)蛋白表达。并检测PVAT过氧化氢(H2O2)含量。研究结果2K1C术后12周RH组大鼠胸主动脉发生血管重构, AngⅡ水平、AGT、ACE mRNA表达均高于SH组,AT1蛋白表达量和H2O2含量也高于SH组,而AT2蛋白量表达两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论PVAT与肾性高血压血管重构相关,活性氧(ROS)可能参与其发生机制。第四部分血管周围脂肪组织中AngⅡ介导VSMCs增殖的机制研究背景我们前期研究发现PVAT与肾血管性高血压血管重构密切相关,然而PVAT调节RAS诱导血管重构机制目前并不清楚。在高血压病理状态下,NAD(P)H氧化酶系来源的ROS通过多种信号途径介导血管平滑肌细胞(vascular smooth musle cell, VSMCs)增殖、迁移,这是血管重构的重要发病机制。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated protein kinase1/2,ERK1/2)是其中较重要的途径之一。PVAT中含有产生ROS的主要酶：NAD(P)H氧化酶系,而Ang Ⅱ可以刺激NAD(P)H产生ROS。研究报道,ROS家族成员HOCL能促使ERK1/2磷酸化而诱导血管VSMCs迁移。因此,本实验利用血管平滑肌细胞,检测H2O2、HOCL表达水平以及通过检测VSMCs增殖指标表达,探讨在PVAT中,介导Ang Ⅱ诱导VSMCs增殖及迁移的机制。研究方法培养大鼠平滑肌细胞,MTT试验检测Ang Ⅱ处理后细胞增殖率,检测AngⅡ处理后活性氧(ROS)、H2O2及HOCL水平；预先予以NADPH抑制剂(apocynin)、H2O2水解酶(catalase)、ERK1/2抑制剂(PD98059)分别作用于Ang Ⅱ处理的细胞,观察对细胞总蛋白、细胞周期的影响,并检测H2O2及HOCL含量的变化。研究结果以Ang Ⅱ终浓度100nM处理24h后可明显诱导细胞增殖,且ROS随着升高；预先予以NADPH抑制剂apocynin、H202水解酶catalase、ERK1/2抑制剂PD98059分别作用于Ang Ⅱ处理的细胞,可抑制细胞增殖；预先予以NADPH抑制剂(apocynin)、H202水解酶(catalase)可降低H202及HOCL含量,但ERK1/2抑制剂(PD98059)无此效应。结论在PVAT中ROS在介导Ang Ⅱ诱导VSMCs增殖的途径可能为Nox/H2O2/HOCL/ERK1/2。