一、研究背景与目的急性心肌缺血是心血管疾病的常见表现，临床上发病率较高。根据急性心肌缺血常见的病因病机及临床表现，该病可归属于祖国医学“心痛”的范畴。用中医学对疾病辨证论治的方法，临床上，心痛的治疗可按心血瘀阻、痰浊内阻、阴寒凝滞、气阴两虚、心肾阳虚等六种证型分证论治。其中心血瘀阻、痰浊内阻、阴寒凝滞是心痛发作期最常见的三种证型。经文献检索获知，目前已有大量关于急性心肌缺血的西医诊疗的临床与实验研究，以及用中医药或中西医结合疗法抗急性心肌缺血的临床或基础研究的报道。在中医药或中西医结合疗法抗急性心肌缺血的研究方面，大多数的研究焦点集中在以下几个方面：①具体某一中药复方（包括经方或时方）抗急性心肌缺血的临床或实验研究；②中医某一治法的类方（如活血祛瘀类方、加减瓜蒌薤白汤类方等）抗急性心肌缺血的作用机理研究；③其他治法（如针灸）对急性心肌缺血的治疗及机理研究。以上的研究，主要是从纵向的角度研究中医药对急性心肌缺血的治疗作用和机理，然而，从横向的角度探讨中医心痛病的不同治法，对急性心肌缺血的治疗作用机理和途径的比较，以及同一治法在不同途径和作用机理的侧重点、作用效应强弱的比较等方面的研究尚未见报道。基于目前中西医结合抗急性心肌缺血的研究现状，本研究尝试从横向的角度，开展对心痛发作期的三种常用治法（活血祛瘀法、芳香温通法和通阳豁痰法）抗急性心肌缺血的作用机理、途径的深入探讨。本课题通过实验研究，观察心痛发作期的三种常用治法（活血祛瘀法、芳香温通法和通阳豁痰法）的相应代表方（血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤和冠心苏合胶囊）抗急性心肌缺血的作用和机理，并结合分子生物学、免疫组化、血清药理学、形态学等方面的技术和方法，从细胞、分子水平上研究、推导心痛发作期三种不同治法抗急性心肌缺血的作用和途径，并且比较不同治法之间作用途径的异同点、作用效应的差异等。通过本研究，期望能从更深的层次认识中医辨证论治治疗急性心肌缺血的作用机理，体现同病异治的科学内涵。同时，为将来开发不同治疗靶点治疗急性心肌缺血的中药复方建立一定的工作基础。二、研究方法1、心痛发作期不同治法对垂体后叶素致急性心肌缺血大鼠心肌组织的保护作用为了探讨心痛发作期的三种不同治法对于急性心肌缺血的心肌组织的保护作用，本研究选用心痛发作期的三种不同治法（活血祛瘀法、通阳豁痰法、芳香温通法）的相应代表方：血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤、冠心苏合胶囊分别作用于垂体后叶素（Pit）所致的急性心肌缺血的大鼠模型，观察这三种方药对pit致急性心肌缺血大鼠的血浆ET、心肌组织eNOs的mRNA表达以及大鼠心电图的影响，从而推导心痛发作期的三种不同治法通过抵抗冠状动脉痉挛，保护、改善心肌组织的血液循环等途径对抗急性心肌缺血的机理。（1）垂体后叶素（Pit）致大鼠急性心肌缺血模型的建立用于实验造模的Pit剂量的确定：用不同剂量的Pit给予大鼠尾静脉注射，然后记录、观察大鼠心电图的变化，以心电图ST段上移0.1mv以上，可确定为大鼠心肌缺血的心电图诊断。（2）分别用血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤、冠心苏合胶囊的制剂给予体重180～220g的SD大鼠灌胃，连续7天。然后在麻醉状态下用Pit给予大鼠尾静脉注射，造成大鼠急性心肌缺血。随后，记录注射Pit后15s～10min时间段大鼠的心电图变化。（3）心脏取血，分离血清，用放免法检测大鼠血浆ET的含量，RT-PCR法检测心肌组织eNOs的mRNA表达。2、心痛发作期不同治法对急性心肌缺血大鼠心肌组织的凋亡相关基因bcl-2、bax的mRNA表达的影响实验大鼠经用上述方法灌胃和注射Pit后，开胸取心脏，选取心尖部心肌组织，用RT-PCR方法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的mRNA表达，并计算bcl-2／bax的比值。3、心痛发作期不同治法对新生大鼠离体心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用通过研究心痛发作期的三种常用治法（活血祛瘀法、通阳豁痰法和芳香温通法）的代表方—血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤、冠心苏合胶囊的含药血清对新生大鼠离体心肌细胞缺氧／复氧损伤后细胞生存率、细胞凋亡率、细胞MDA含量、乳酸脱氢酶（LDH）活性等的干预作用，从而推导心痛发作期的三种不同治法对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用。（1）培养原代新生大鼠心肌细胞：取3～5天龄的Wistar系大白鼠乳鼠，开胸取心尖部心肌组织，经0.06％胰蛋白酶液消化，收集消化液，离心，弃去上清液。沉淀加入含20％小牛血清的1640培养液制作细胞悬液，采用差速贴壁分离法纯化心肌细胞。经200目无菌不锈钢网过滤，重新接种在培养瓶中，放入二氧化碳培养箱（37℃，5％CO₂）中进行培养。培养5～7天的大鼠心肌细胞用于实验。（2）建立大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型：将生长良好的大鼠心肌细胞的培养基倒掉，用纯氮气（99.99％）饱和的缺氧培养基冲洗，再取缺氧培养基加入培养瓶中，同时向瓶内充氮气10秒钟以置换瓶内空气，紧闭瓶塞，置于37℃温度下培养4h为缺氧。然后用经过95％O₂和5％CO₂混合气体饱和的模拟再灌注培养基置换缺氧培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育2h为复氧。用MTT法测定缺氧／复氧前后心肌细胞的生存率以及测定缺氧／复氧前后心肌细胞的MDA含量和细胞上清液的LDH含量，检测造模是否成功。（3）制备含药血清：分别用血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤、冠心苏合胶囊的药物制剂给予大鼠灌胃，连续3天，最后一次灌胃后50min，进行大鼠心脏取血，离心，分离血清。血清经灭活后置于—80℃冰箱中保存待用。（4）用MTT法确定用于干预大鼠心肌细胞缺氧—复氧的药物血清浓度。（5）各实验组的大鼠心肌细胞，先用经过实验（4）确定浓度的含药血清，预处理3h，然后进行缺氧4h，复氧2h。（6）用全自动生化仪检测各组心肌细胞的MDA含量及LDH的活性。（7）取上述缺氧—复氧后的心肌细胞，用MTT法检测各组心肌细胞的生存率。（8）用TUNEL法，检测心肌细胞凋亡率：取缺氧—复氧后的各组心肌细胞，用4％多聚甲醛溶液固定，接着进行内源性过氧化物酶的阻断和细胞的通透，然后滴加TUNEL反应混合溶液进行标记，荧光显微镜下分析结果，并计算细胞凋亡指数。三、研究结果1．建立了本研究的垂体后叶素（Pit）致大鼠急性心肌缺血的模型，经过心电图的检测和统计学的分析，说明造模成功。确定了用于造模的Pit实际剂量为1.5u／kg（大鼠尾静脉注射），并且于注射后30s～10min时间内出现典型的心肌缺血的心电图，表现为ST段抬高，心律失常、甚至伴有Q波的出现等。2．心痛发作期三种不同治法相应的代表方对Pit致急性心肌缺血大鼠的心电图有明显的改善作用。在高剂量时，活血祛瘀法作用效应最强。低剂量时，芳香温通法作用效应最强，其次为活血祛瘀法，再次为通阳豁痰法。3．心痛发作期的三种不同治法均可通过降低血浆ET水平的途径发挥抗急性心肌缺血的作用。三种治法比较，降低急性心肌缺血的血浆ET水平的作用效应存在着差异，其中，活血祛瘀法降ET作用效应最强。4．心痛发作期的三种不同治法均能通过上调心肌eNOS的mRNA表达，提高eNOS的活性，发挥对急性缺血的心肌组织的保护作用。但三种治法的作用效应存在着显著差异，体现在：高剂量水平时，通阳豁痰法的作用效应最强，显著优于活血祛瘀法和芳香温通法。低剂量水平时，芳香温通法作用效应最强，显著优于通阳豁痰法和活血祛瘀法；而通阳豁痰法又显著优于活血祛瘀法。5．心痛发作期的三种不同治法均能上调bcl—2／bax比值，即上调抑凋亡基因bcl-2的mRNA表达，或／和下调促凋亡基因bax的mRNA表达，以减少心肌细胞的凋亡，从而对心肌组织起保护作用。三种不同治法对bcl-2／bax比值的上调作用效应存在着显著的差异，表现为：芳香温通法作用效应最强，其次为通阳豁痰法，再次为活血祛瘀法。同时，通阳豁痰法和芳香温通法的代表方药物组大鼠心肌组织的bcl—2／bax的比值显著高于正常对照组。6．新生大鼠心肌细胞经缺氧4h，复氧2h，可明显造成心肌细胞的损伤。可观察到：心肌细胞的搏动频率和幅度显著减少，并且心肌细胞的生存率显著地下降、MDA含量及LDH活性均显著升高，说明造模成功。7．运用心痛发作期的三种不同治法的代表方含药血清对大鼠心肌细胞的缺氧—复氧进行干预，均能显著降低缺氧—复氧损伤大鼠心肌细胞的MDA含量，说明三种治法均有抗氧化作用及清除氧自由基的作用。但三种治法的作用效应有显著的差异，芳香温通法作用效应最强，优于通阳豁痰法和活血祛瘀法。8．心痛发作期的三种不同治法的代表方含药血清均能显著降低缺氧—复氧损伤大鼠心肌细胞LDH的活性，尤其芳香温通法的代表方含药血清作用效应最强，其次为通阳豁痰法的含药血清。可以推测，芳香温通法对心肌细胞缺氧—复氧损伤的保护作用最强，其次是通阳豁痰法，再次为活血祛瘀法。9．三种治法的代表方含药血清均能显著降低缺氧—复氧损伤的心肌细胞的凋亡指数，其中芳香温通法代表方含药血清作用效应最强，其次为通阳豁痰法代表方含药血清，再次为活血祛瘀法代表方含药血清；说明，心痛发作期三种不同治法均有通过抗心肌细胞凋亡的途径，对缺氧—复氧损伤的心肌细胞发挥保护作用。三种治法当中，芳香温通法作用效应最强，其次为通阳豁痰法，再次为活血祛瘀法。10．心痛发作期的三种不同治法代表方含药血清均能显著提高缺氧—复氧损伤的心肌细胞的生存率，说明三种不同治法均能提高缺氧—复氧状态下心肌细胞的生存率；并且本结果还提示：芳香温通法和通阳豁痰法的作用效应显著优于活血祛瘀法。四、结论1．心痛发作期的三种不同治法—活血祛瘀法、通阳豁痰法和芳香温通法，均能通过多种途径①调节血管舒缩因子的分泌，减少缩血管因子ET的合成与分泌，抵抗冠状动脉痉挛，维持冠脉循环血量；②调节心肌细胞凋亡相关基因的表达；③抑制氧自由基生成或／和加强对氧自由基的清除；④提高心肌细胞在缺氧—复氧损伤中的生存能力（生存率）；⑤抑制缺氧—复氧损伤的心肌细胞的凋亡等途径，发挥抗急性心肌缺血的作用。2．心痛发作期的三种不同治法抗急性心肌缺血的多种作用途径相互间是有着相互关联性和协同作用的。表现在：①保护心肌的功能方面，其一通过减少缩血管因子ET的合成与分泌，达到抗动脉痉挛、维持冠脉血流量，保证心肌血供：其二通过调节心肌组织eNOS的mRNA表达，提高eNOS的活性，促进内源性一氧化氮（eNO）的合成，维持心肌（尤其是心室肌）舒缩功能，两者的协同作用，保护心肌组织的功能。②抗心肌细胞凋亡方面，一是通过调节心肌细胞凋亡的相关基因的比例，上调抗凋亡基因bcl-2的表达，下调促凋亡基因bax的表达；二是通过抑制自由基形成或／和加强对氧自由基的清除，两方面的协同作用可抑制心肌细胞的凋亡，提高细胞的生存率，从而对心肌细胞的缺氧—复氧损伤发挥保护作用。3．心痛发作期的三种不同治法抗急性心肌缺血的作用对于不同的途径，其作用效应有显著差异。表现在①活血祛瘀法侧重于通过降ET的途径起抗急性心肌缺血的作用，其作用效应显著优于通阳豁痰法和芳香温通法。②芳香温通法和通阳豁痰法侧重于通过抑制氧自由基形成或／和加强对氧自由基的清除；促进eNOS的mRNA表达，增加舒血管、保护心肌组织的NO合成；以及抗缺氧—复氧损伤导致的心肌细胞凋亡等途径，保护心肌细胞，抵抗缺氧—复氧损伤。这两种治法在这几种途径的作用效应显著优于活血祛瘀法。4．心痛发作期的三种不同治法中，芳香温通法和通阳豁痰法在抗急性心肌缺血的多种作用途径上都显著优于活血祛瘀法。尤其是芳香温通法，在多种抗急性心肌缺血的作用途径上作用效应都是最强的，这与临床上冠心病心绞痛急性发作时，常常首选芳香温通法（药物）进行急救相吻合。