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研究背景与目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是最常见的糖尿病微血管并发症,是慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）及终末期肾脏疾病（End-stage renal disease,ESRD）的主要病因之一。本课题组前期研究证实,体外高糖刺激可导致足细胞损伤[1],但高糖导致足细胞损伤的分子机制并不明确。近年来,足细胞线粒体结构与功能异常在DN发生、进展中的作用受到广泛关注。除线粒体功能改变、能量代谢异常外,有研究表明,线粒体动力学改变导致的线粒体分裂融合异常及形态改变在糖尿病发生和进展中起重要作用[2]。研究发现,动力相关蛋白1（Dynamin-related protein1,Drp1）在足细胞线粒体分裂进程中起到至关重要的作用,其磷酸化激活参与多种疾病状态下线粒体动力学改变、功能异常以及细胞损伤[3,4],但糖尿病肾病中导致Drp1磷酸化的上游分子机制尚不明确。AKAP1是A激酶锚定蛋白（A kinase anchoring proteins,AKAPs）家族中第一个被发现的成员。其氨基端含有蛋白激酶A（Protein A,PKA）结合序列,通过与PKA结合参与第二信使环磷腺苷（cyclicAMP）介导的胞内信号转导作用。已有研究表明,AKAP1表达改变参与疾病状态下线粒体分裂的调控[5],但AKAP1在糖尿病肾病中的研究尚未报道。本研究拟观察体外培养人足细胞中高糖刺激对足细胞线粒体形态结构以及足细胞凋亡的影响,并验证AKAP1/Drp1信号通路在这一过程中的作用,评价AKAP1信号通路对高糖诱导的足细胞损伤及线粒体动力学改变中的作用,从而进一步探讨高糖诱导足细胞线粒体损伤的分子机制。方法:第一部分:收集武汉大学人民医院肾内科31例临床肾穿刺确诊为DN患者的肾活检标本,取6例肾肿瘤患者肿瘤旁正常组织标本为对照组,电镜观察各组足细胞线粒体形态,对足细胞线粒体纵横比进行定量分析。第二部分:体外培养条件永生性人足细胞,待足细胞完全分化后进行同步化处理。实验分组:1、按葡萄糖浓度分别为5、15、25、35mmol/L刺激足细胞48小时;2、高糖（35mmol/L）培养基分别刺激足细胞12、24、36、48h;免疫荧光染色检测各组中AKAP1的表达及分布情况,免疫印迹法分别检测各组足细胞中AKAP1,Drp1,p-Drp1（Ser637）及p-Drp1（Ser637）/Drp1的表达改变;第三部分:体外培养条件永生性人足细胞,待足细胞完全分化后进行同步化处理。实验分组:正常对照组（5 mM葡萄糖）、高渗对照组（30mmol/L甘露醇+5mmol/L葡萄糖）、高糖组（35mmol/L葡萄糖）、高糖（35mmol/L葡萄糖）+AKAP1siRNA组。电镜观察各组足细胞线粒体形态,对线粒体长度及纵横比进行定量分析;Mitotracker Red染色后荧光观察各组足细胞线粒体形态,对长度、纵横比、形状系数定量分析;流式细胞术评价各组足细胞凋亡水平;Western印迹检测足细胞中AKAP1,Drp1,p-Drp1（Ser637）及p-Drp1（Ser637）/Drp1表达改变。结果第一部分:与正常组比较,临床确诊为糖尿病肾病患者肾活检组织中足细胞损伤,足突融合伴线粒体分裂增加、纵横比降低（P<0.05）。第二部分:（1）AKAP1分布在足细胞胞质中,与正常对照组相比,高糖刺激使AKAP1表达水平增加,且以时间、浓度依赖方式增加;（2）高糖刺激使Drp1,p-Drp1（Ser 637）表达及p-Drp1（Ser637）/Drp1以时间、浓度依赖方式增加。第三部分:（1）与正常组比较,高糖刺激使线粒体分裂增加、纵横比及形状系数降低（均P<0.05）;与高糖组比较,AKAP1 siRNA转染后线粒体分裂减少,线粒体纵横比及形状系数升高（均P<0.05）;高渗对照组与正常组差异无统计学意义;（2）与正常组比较,高糖刺激导致足细胞凋亡增加（P<0.05）;与高糖组比较,AKAP1siRNA转染后足细胞凋亡减少,高渗对照组与正常组差异无统计学意义;（3）与正常组比较,高糖刺激导致足细胞AKAP1,Drp1,p-Drp1（Ser637）表达增加,p-Drp1（Ser637）/Drp1增加;与高糖组比较,AKAP1siRNA转染后,p-Drp1（Ser637）表达降低,p-Drp1（Ser637）/Drp1降低,Drp1表达无显著变化。结论:高糖刺激下AKAP1通过磷酸化线粒体动力相关蛋白Drp1调控足细胞线粒体分裂,导致足细胞损伤。