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研究背景黑素瘤是一种起源于黑素细胞的皮肤恶性肿瘤,具有恶性程度高、死亡率高等特点。近年来,黑素瘤在全球范围内发病率呈快速增长趋势,已经是欧美地区发病率增长速度最快的恶性肿瘤之一。我国属黑素瘤发病率较低地区,但由于我国人口基数大黑素瘤患者人数众多,并且我国黑素瘤发病率也处于持续增长状态,因此对黑素瘤进行深入的分子机制研究对提高黑素瘤的诊疗效果、提高国民健康水平具有重要意义。根据以往研究,多种信号转导通路中的重要分子参与了黑素瘤的发生发展。BRAF和NRAS是MAPK通路中的关键蛋白激酶,在超过50%的黑素瘤病例中存在活化性基因突变,突变的BRAF和NRAS基因使MAPK通路过度激活促进黑素瘤细胞的增殖。PI3K通路中的抑制分子PTEN在黑素瘤中存在较高频率的失活突变,突变的PTEN丧失对PI3K通路的抑制活性,从而促进黑素瘤细胞增殖。此外,较多研究证实起源于外胚层神经嵴细胞的黑素细胞在其恶性转化过程中神经系统胚胎发育相关的转录因子表达量增加。MITF是胚胎发育过程中促进神经嵴细胞分化为黑素细胞的重要转录因子,在部分黑素瘤患者肿瘤组织中高表达并发挥促进细胞增殖的作用;神经系统胚胎发育相关的SOX家族多种转录因子,如SOX2、SOX4、SOX9等均参与到黑素瘤细胞增殖、凋亡及转移等过程。近年研究发现,主要表达于胚胎早期神经细胞内的POU家族转录因子,如POU5F1、POU3F2等,在黑素瘤组织及细胞系中高表达并发挥促肿瘤作用。POU4F1是POU转录因子家族中的重要分子,在胚胎发育的早期表达于中枢神经前体细胞。转录因子POU4F1可与Bcl-2基因启动子区结合调控Bcl-2基因的表达,并可与P53蛋白发生蛋白质间相互作用调控其转录活性。通过以上作用,转录因子POU4F1可发挥促进神经系统分化和抑制神经细胞凋亡的作用。肿瘤研究中发现POU4F1具有促进细胞增殖的作用,黑素瘤中POU4F1可保护细胞基因组DNA并降低DNA损伤程度,逆转由于BRAF突变导致的细胞衰老现象,从而促进黑素瘤的发生和发展。但是目前尚缺少黑素瘤中转录因子POU4F1作用的全面研究,且POU4F1在黑素瘤细胞中的作用机制尚不清楚。因此,本课题旨在全面地检测转录因子POU4F1在黑素瘤发生发展中发挥的作用,并对其作用机制做进一步的研究。研究方法1.使用Real-time PCR对原代黑素细胞、黑素细胞系、黑素瘤细胞系,以及色素痣组织和黑素瘤组织中POU4F1 mRNA水平表达量的检测。2.通过Western blot检测POU4F1在原代黑素细胞、黑素细胞系、黑素瘤细胞系以及色素痣组织和黑素瘤组织中的蛋白表达水平。3.使用lipo3000转染试剂将POU4F1质粒转染入Hs 294T和A2058细胞内,使细胞过表达POU4F14.CCK8试剂对不同生长时间点的细胞染色,比较POU4F1过表达组与对照组细胞生长数量的差异。5.AnexinⅤ-FITC和PI染色体系对POU4F1过表达组与对照组细胞进行标记,流式细胞术检测各组细胞中凋亡细胞的数量。6.Western blot技术检测过表达POU4F1细胞内磷酸化ERK的含量。7.使用克隆形成实验技术,对POU4F1过表达组与对照组细胞生长两周后细胞克隆数进行比较,并分析两组在ERK剂作用下细胞克隆形成数量的差异。研究结果1.转录因子POU4F1在恶性黑素瘤细胞系和组织中的表达各细胞系及组织中均存在POU4F1转录因子的表达,且mRNA水平与蛋白水平表达水平一致。细胞系中实验结果显示:中原代黑素细胞和黑素细胞系中POU4F1转录因子的表达量较低,而黑素瘤细胞系中POU4F1表达量较高;组织中实验结果显示:黑素瘤组织中POU4F1蛋白表达量显著高于色素痣组织(n=8,P<0.05)。2.转录因子POU4F1在黑素瘤细胞中的作用POU4F1低表达的黑素瘤细胞可外源地提高POU4F1的表达(约2.3倍,P<0.05)。过表达POU4F1的黑素瘤细胞相较于对照组,细胞在转染过表达质粒后第72小时和第96小时,细胞数量均明显增高(P<0.001)。凋亡水平检测结果显示:在H2O2刺激下,过表达POU4F1组细胞凋亡水平显著低于对照组细胞(过表达组33.8%±1.25%,对照组20.2%±0.83%,P<0.01)。细胞迁移实验结果示:过表达POU4F1对黑素瘤细胞的迁移能力无显著影响(过表达组135.7±6.8,对照组124±9.8,P>0.05)。3.转录因子POU4F1促黑素瘤细胞增殖机制的初步探讨过表达POU4F1的黑素瘤细胞内,ERK的磷酸化水平显著增高(约3.5倍,P<0.01)。克隆形成实验结果显示:过表达POU4F1组细胞克隆形成数显著高于对照组(过表达组为542±3.4,对照组为304±3.9,P<0.001);过表达POU4F1的细胞给予ERK抑制剂处理后,细胞克隆数显著降低(过表达组为542±3.4,过表达+抑制剂组为126±2.6,P<0.001)。ERK上游激酶MAP2K2基因启动子区存在POU4F1转录因子结合位点,并且POU4F1过表达细胞内MAP2K2的mRNA和蛋白水平均升高。研究结论通过以上研究,我们证实POU4F1在黑素瘤中表达量高于原代黑素细胞及色素痣组织,并首次在黑素瘤细胞中明确了POU4F1具有促进细胞增殖并抑制细胞凋亡的作用。针对POU4F1的促肿瘤增殖作用,我们进一步探讨了POU4F1对ERK活性的激活作用,提示POU4F1通过激活ERK活性促进黑素瘤细胞增殖。转录因子POU4F1过表达可能对MAPK通路中的关键蛋白激酶MAP2K2具有转录调控作用,黑素瘤中高表达的POU4F1可能通过促进MAP2K2蛋白的表达激活下游ERK分子,从而增强MAPK通路的活性促进黑素瘤细胞的增殖。我们的研究首次证实了POU4F1具有促进MAPK通路激活的作用,这一作用参与了黑素瘤细胞的增殖过程,并在黑素瘤耐药机制中可能发挥重要功能,这为黑素瘤BRAF靶点治疗的耐药机制提供了新的研究方向。