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苦参碱是中药苦参的主要成分之一,我们前期研究发现苦参碱诱导了人白血病K562细胞分化和凋亡,但是分子机制尚不清楚。DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一,在肿瘤的基因异常表达起着重要作用。文献报道RIZ1基因是一种抑癌基因,在K562细胞中由于RIZ1基因启动子高甲基化导致其表达低下。在本论文中我们分别采用RT-PCR和甲基化特异性PCR(MSP)技术研究了苦参碱作用K562细胞后,其RIZ1基因mRNA表达水平和RIZ1基因启动子甲基化情况。同时我们还运用毛细管电泳(HPCE)、高效液相(HPLC)和甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)技术检测了苦参碱对K562细胞基因组整体甲基化的影响。此外,利用RT-PCR技术还测定了RIZ1下游基因IGF-1 mRNA水平的表达情况。方法:1.以5-Aza CdR为去甲基化对照药物,分别用苦参碱、苦参提取液处理常规培养的白血病细胞K562株。根据实验观察的需要设置不同时间处理组。2.利用半定量RT-PCR方法检测了苦参碱作用K562细胞不同时间后RIZ1基因mRNA水平表达的变化,并同苦参提取液与DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza CdR分别诱导的RIZ1基因表达变化进行了比较。还利用RT-PCR检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理前后DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA及IGF-1 mRNA表达的变化。3.运用MSP检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理前后RIZ1启动子甲基化状态。4.利用HPCE、HPLC、甲基化敏感性限制性内切酶法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后对基因组整体甲基化水平的影响。结果:1.通过实验发现RIZ1基因的mRNA在对照组K562细胞低表达,经苦参碱和苦参提取液作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达明显升高,并呈时间依赖性;同样,5-Aza CdR作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达也明显增高。2.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后,RIZ1基因启动子发生去甲基化。3.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3BmRNA表达无明显变化。4.HPCE、HPLC法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后基因组整体甲基化水平较处理前稍降低,但无统计学意义。5.用酶切法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后对基因组整体甲基化水平无明显影响。6.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后IGF-1 mRNA表达无明显变化。结论:1.K562细胞抑癌基因RIZ1启动子是处于高甲基化状态,导致该基因低表达。苦参碱和苦参提取液作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达明显升高,说明苦参碱抗白血病作用与诱导抑癌基因RIZ1表达有关。2.苦参碱诱导K562细胞抑癌基因RIZ1上调与中药苦参提取液作用一致,提示苦参碱是苦参抗肿瘤作用的主要活性成分。3.实验结果显示苦参碱、苦参提取液和5-Aza CdR处理K562细胞后RIZ1启动子发生去甲基化,提示RIZ1基因被诱导表达上调是RIZ1基因启动子去甲基化作用所致。4.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3BmRNA表达无明显变化,说明苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR未通过调控DNMTsmRNA转录水平而诱导DNA去甲基化。5.HPCE、HPLC法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理后基因组整体甲基化水平较处理前稍降低,而用甲基化敏感性限制性内切酶法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理前后对基因组整体甲基化水平无明显影响,综合说明苦参碱、苦参提取液对K562细胞基因组DNA整体甲基化水平无明显作用。6.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后,RIZ1基因下游的IGF-1基因mRNA并没有随RIZ1表达上调而发生明显变化,其原因在本研究中尚不清楚。