研究背景分子、细胞到机体乃至大到群体等各个层次,在生命过程中都有明显的时间周期现象,生物节律的重要作用就是使生物能更好地适应环境,维持机体生命功能的稳定。昼夜节律以24小时为一个周期,控制包括睡眠-觉醒周期、代谢和激素分泌在内的一系列生理过程。昼夜节律基因系统包含至少12个基因,它们彼此之间可形成多个反馈调控环路,调节体内约10%的基因表达,参与包括细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭在内的多种生物过程。节律分子在体内平衡的破坏可诱发器官特异性疾病,如肥胖、糖尿病、自身免疫性疾病和肿瘤等。胃癌是影响人类健康的重大疾病,世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)已将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)确定为一级致癌物,是胃癌发生的风险因素。幽门螺杆菌感染介导恶性转化经历慢性浅表性胃炎-慢性萎缩性胃炎伴肠化生-异型增生-胃癌的演进过程,其中胃炎是胃粘膜恶性转化的初级阶段。幽门螺杆菌介导胃部炎症以及恶性转化涉及机制复杂,尚未完全阐明。胃肠道细胞可自主调控昼夜节律分子,使细胞具有昼夜节律性,表明局部因素可能以直接作用于特异性细胞的方式影响细胞内节律分子的表达。另一方面,幽门螺杆菌可影响胃酸分泌的昼夜节律性,这预示了昼夜节律与幽门螺杆菌诱发的疾病之间存在潜在联系。此外,也有其它研究发现昼夜节律与炎症性疾病之间存在一定的关系。因此,我们认为节律分子在幽门螺杆菌诱导的胃部炎症和恶性转化中可能发挥作用。我们前期筛选发现,在幽门螺杆菌感染及胃粘膜上皮细胞恶性转化的过程中,节律分子BMAL1的表达明显上调。BMAL1作为转录因子在节律分子反馈调控环路中处于核心位置。研究表明,单核细胞、内皮细胞、上皮细胞和间充质细胞等细胞中BMAL1表达异常时,可通过调控细胞因子、趋化因子、转录因子、糖皮质激素受体及代谢相关分子,影响包括肺炎、关节炎和血栓炎症在内的一系列炎症反应。此外,BMAL1在肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、鼻咽癌等肿瘤中均有表达异常的现象。因此,本研究拟探讨节律分子BMAL1在幽门螺杆菌诱导的胃炎进程中的作用以及BMAL1异常表达促进胃恶性转化的调控机制。本研究旨在通过阐述胃炎向胃癌进展的不同阶段中昼夜节律分子的表达及调控机制,说明节律分子在胃部组织恶性转化过程中的作用。研究目的(一)探究节律分子BMAL1与幽门螺杆菌感染诱导炎症因子表达促进胃炎进展的内在联系及其调控机制;(二)探究节律分子BMAL1在胃部炎癌跨越过程中的作用及其调控机制。方法和结果(一)幽门螺杆菌促进RNA结合蛋白LIN28A表达,LIN28A结合在节律基因BMAL1的启动子区激活其转录表达,BMAL1又发挥转录因子功能,转录激活促炎细胞因子TNF-α的表达,从而促进炎症进展。1.在GEO数据库的公共微阵列数据中对经典昼夜节律基因的相对表达进行分析,发现在幽门螺杆菌感染的情况下,小鼠来源的细胞系中Bmal1表达显着增加。免疫组织化学(IHC)染色显示,在有或无幽门螺杆菌感染的浅表性胃炎、萎缩性胃炎及肠上皮化生的患者组织中,幽门螺杆菌感染的患者组织中BMAL1的表达显着高于未感染的患者组织。相应地,对另一组标本的RT-PCR分析显示,幽门螺杆菌阳性患者组织中的BMAL1表达也高于幽门螺旋杆菌阴性的患者。在体外实验中,使用两种幽门螺杆菌菌株(H.p 11637和H.p 26695)感染胃上皮细胞系AGS和BGC-823,通过RT-PCR和Western blot的分析,发现幽门螺杆菌可促进细胞中BMAL1的表达,且这种上调对幽门螺杆菌感染的时间和浓度有依赖性。在节律重置的胃上皮细胞中,RT-PCR显示幽门螺杆菌感染破坏了 BMAL1表达的节律性。2.Targetscan网站显示BMAL1的3’UTR区域含有let-7a-3p的结合位点。RT-PCR 和 Western blot 显示 let-7a-3p 可抑制 LIN28A 和 BMAL1 的表达。然而,双荧光素酶测定的结果显示let-7a-3p不能通过与BMAL1的3’UTR区结合来直接激活其转录。基于上述结果,我们推测let-7a-3p通过LIN28A间接调节BMAL1的表达。在对LIN28A进行过表达或干扰后,RT-PCR和Western blot显示BMAL1表达发生相应的上调或下调。染色质免疫沉淀测定(ChIP)显示LIN28A可与BMAL1的启动子直接结合。双荧光素酶实验则进一步证实LIN28A可直接转录激活BMAL1。3.RT-PCR和Western blot分析显示幽门螺杆菌以时间和浓度依赖的方式促进 LIN28A 的表达。将“LIN28Asi+Hp26695”与“NC+Hp26695”组相比较,RT-PCR和Western blot也显示对LIN28A进行干扰后,幽门螺杆菌诱导的BMAL1的表达降低。IHC染色显示幽门螺杆菌阳性患者的LIN28A表达高于幽门螺杆菌阴性患者,对IHC图片进行光密度分析后的相对值也可反映这一差异。4.对GEO数据库的分析显示,小鼠来源的细胞系中幽门螺杆菌可以显著激活Tnf的表达。通过RT-PCR实验,我们发现人源细胞系中BMAL1干扰后,检测的炎性因子中 TNF-α的下降最明显。将“BMAL1si+Hp26695”与“NC+Hp26695”组进行比较,BMAL1的干扰可抑制幽门螺杆菌对TNF-α表达的诱导。另外,BMAL1的过表达则促进TNF-α的表达。以上两个结果均使用RT-PCR实验验证。酶联免疫吸附实验(ELISA)显示TNF-α分泌的变化与其mRNA水平的变化一致。由于BMAL1属于昼夜节律基因,因此TNF-α作为其靶基因,也应具有节律性。RT-PCR和ELISA实验表明,节律同步化的细胞中,幽门螺杆菌的感染可破坏TNF-α表达和分泌的节律性。然而当BMAL1被抑制时,这种由幽门螺杆菌引起的TNF-α的节律变化则得以恢复。5.基于TNF-α启动子区中E-box元件的分布,我们使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit 试剂盒分区域对其进行敲除并使用双荧光素酶实验来检测BMAL1对TNF-α启动子的转录激活作用。我们发现敲除K05组的E-box元件时,即使BMAL1被干扰,BMAL1对TNF-α的转录激活情况也没有改变。由于K05组中有两个E-box元件,我们将这两个位点分别用KOD-Plus-Mutagenesis Kit试剂盒进行突变,并用双荧光素酶实验检测。我们发现这两个位点对BMAL1转录激活TNF-α的过程均十分重要。此外,我们通过ChIP证实BMAL1可以与TNF-α启动子中的上述两个位点直接结合。6.我们构建了一个小鼠模型。该模型包含4组小鼠,其中2组在12小时光照12小时黑暗(LD)的环境中,分别在中午12点用PBS或幽门螺杆菌菌株SSI灌胃。其他2组在持续黑暗(DD)的环境中,分别在中午12点用PBS或幽门螺杆菌菌株SSI灌胃。RT-PCR和IHC显示幽门螺杆菌感染可使Bmal1表达上调2倍。我们使用May-Grunwald-Giemsa试剂盒对幽门螺杆菌进行染色,发现在节律分子Bmal1表达异常最明显的“DD+SSI”组中,胃内幽门螺杆菌定植阳性的小鼠数量显着增加。这表明节律分子表达异常可促进幽门螺杆菌的定植。炎症指数的评分内容包括幽门螺杆菌感染率,炎性细胞浸润的细胞类型、深度和位置。与“LD+SSI”组相比,“DD+SSI”组的小鼠炎症指数更高,说明节律分子的异常表达可加重幽门螺杆菌诱导的炎症。我们使用苏木精-伊红(HE)染色观察炎症细胞的浸润情况,并发现“DD+SSI”组有炎症细胞浸润的小鼠数量最多,浸润粘膜层和粘膜下层的炎症细胞比例也最高。同样地,RT-PCR分析显示,与“LD+SSI”组相比,在“DD+SSI”组中幽门螺杆菌刺激下小鼠胃上皮细胞的Tnf表达显着增加。(二)IL-1β/IL-1R1-NF-κB 诱导的 BMAL1 激活 IL-1R1 表达,在 BMAL1和IL-1β/IL-1R1之间形成相互调节的正反馈环路,以促进BMAL1在胃癌中的高表达。BMAL1通过直接靶向Cyclin D1促进胃癌细胞异常增殖。1.通过分析GEO数据库,我们发现节律基因BMAL1在能够发展为胃癌的肠上皮化生组织中的表达增加。我们使用RT-PCR检测慢性萎缩性胃炎和胃癌中的节律基因BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2,结果显示只有BMAL1在胃癌组织中表达明显升高。免疫组织化学(IHC)染色显示在癌症进展的不同阶段BMAL1表达均有上调,并且这种上调可由IHC光密度的相对值反映。选择另一组胃癌患者的癌症和癌旁组织进行检测。RT-PCR和Western blot结果显示BMAL1在癌组织中表达上调。2.克隆形成实验和EdU染色显示BMAL1可在体外促进胃癌细胞增殖。裸鼠皮下成瘤实验证实BMAL1也可以促进体内肿瘤的生长。3.RT-PCR和Western blot结果显示BMAL1可促进cyclin D1表达。克隆形成实验和EdU染色实验表明,cyclin D1的干扰可明显减弱BMAL1过表达引起的胃癌细胞的增殖。双荧光素酶测定和染色质免疫沉淀(ChIP)测定显示BMAL1可与cyclin D1启动子结合并直接转录激活cyclin D1。4.RT-PCR和Western blot显示外源性IL-1β的刺激可上调BMAL1。Western blot结果说明,NF-κB信号通路抑制剂可抑制IL-1β诱导的BMAL1的表达上调。RT-PCR和Western blot结果进一步展示,NF-κB信号通路可介导由IL-1β诱导的BMAL1的表达上调。染色质免疫沉淀实验和双荧光素酶实验表明P65可与BMAL1启动子结合并直接转录激活BMAL1。5.对GEO数据库中的公共微阵列数据进行分析,我们发现IL-1R1在能够发展为胃癌的肠上皮化生组织中的表达增加。相关性分析显示,IL-1R1表达与BMAL1的表达呈明显的正相关关系。RT-PCR和Western blot结果显示BMAL1可促进IL-1R1的表达。染色质免疫沉淀实验和双荧光素酶实验表明BMAL1可与IL-1R1启动子结合并直接转录激活IL-1R1。6.RT-PCR和Western blot实验显示BMAL1可介导由IL-1β诱导的cyclin D1和IL-1R1的上调。Western blot还显示BMAL1的过表达可以进一步加剧由IL-1β 引起的 cyclin D1、IL-1R1、p-P65 和 P65 的上调。Western blot 显示,用IL-1R 拮抗剂(IL-1RA)处理后,BMAL1、cyclin D1、IL-1R1、p-P65 和 P65表达下降,但BMAL1的过表达可缓解IL-1RA对cyclin D1、II-1R1、p-P65和P65的下调。节律同步化的胃上皮细胞中,RT-PCR显示IL-1β的刺激可破坏BMAL1、cyclin D1和IL-1R1表达的节律性,但干扰BMAL1后,cyclin D1和IL-1R1的节律性可部分恢复。7.在小鼠模型中,在幽门螺杆菌感染同时加入甲基亚硝基脲(MNU)的情况下,Ki67、BMAL1、P65、cyclin D1和IL-1R1的免疫组化水平表达上调。在另一组人体标本中,癌症组织中的Ki67、BMAL1、Ki67、P65、cyclin D1和IL-1R1的免疫组化水平表达更高。对免疫组化光密度的相对值进行相关性分析,发现BMAL1的表达与Ki67、P65、CCND1和IL-1R1呈正相关关系。研究结论(一)我们发现幽门螺杆菌可上调RNA结合蛋白LIN28A的表达,而LIN28A通过直接与BMAL1启动子结合促进BMAL1的转录和表达;BMAL1直接与TNF-α启动子上的E-box元件结合,通过促进TNF-α的转录增加其分泌。因此,我们的研究揭示了节律分子BMAL1异常表达可加重幽门螺杆菌诱导的炎症反应的机制,即从节律分子视角丰富了幽门螺杆菌感染的致病机制。(二)我们发现幽门螺杆菌诱导表达升高的IL-1β,可与胃上皮细胞表面的IL-1R1结合,激活细胞内的NF-κB信号通路,并最终在转录水平促进节律基因BMAL1的表达。BMAL1通过与IL-1R1启动子区的E-box元件结合促进IL-1R1表达,从而使胃上皮细胞对IL-1β的刺激更敏感。因此,IL-1β/IL-1R1和BMAL1之间可形成正反馈环路,进一步促进BMAL1的表达。过表达的BMAL1可通过激活cyclin D1的异常表达促进胃上皮细胞的异常增殖。因此,我们的研究初步证实了 BMAL1在胃部炎癌转化过程中的作用,即从节律分子BMAL1视角丰富了胃粘膜恶性转化的机制。