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第一部分非靶向MRI荧光双模态探针的构建及表征目的:合成一种新型的非靶向MRI荧光双模态探针Cd Te·BSA-Gd3+,并对其理化性质进行表征。材料与方法:1.近红外量子点Cd Te的合成:1)称取Te(50.8 mg)、Na BH4(75.6 mg)装入圆底烧瓶(10 ml)中,密封后80℃水浴反应,生成Na HTe前体,室温保存备用;2)将Cd Cl2(228 mg)溶于40 ml双蒸水中,加入巯基丙酸128μl。调节p H至11-12。室温下通N2除氧20 min,升温至90℃后加入1.3 ml合成的Na HTe,维持N2通气,加热至100℃,反应4 h后,每隔15 min取样并检测,当波长达到750±20 nm时终止,得到近红外Cd Te量子点,冷却备用。2.BSA-Gd3+-DTPA的合成:1)称取BSA粉末200 mg,溶于3 ml Na HCO3溶液中(0.1 mol/L,p H=8.5)。将DTPAA(200 mg)溶于1 ml DMSO溶液,充分搅拌后逐滴加入至BSA中,调p H至8.5,室温反应2 h,得到BSA-DTPAA溶液。利用柠檬酸钠溶液去除多余的DTPAA和DMSO,纯化备用。2)将100 mg Gd Cl3溶解于1 ml CH3COONa溶液(0.1 mol/L,p H=6.0),缓慢滴加至BSA-DTPA,室温反应24 h,柠檬酸钠溶液(0.1 mol/L,p H=6.5)透析,纯化后冻干得到粉末状BSA-Gd3+-DTPA,4℃保存备用。3.Cd Te·BSA-Gd3+非靶向MRI荧光双模态探针的合成与纯化:称取EDC·HCl 3.8mg,NHS 4.6 mg,分别溶解于200μL双蒸水。先以EDC溶液将Cd Te活化,再加入NHS溶液,室温反应15 min。将活化的Cd Te溶液滴加至5 mg冻干的BSA-Gd3+-DTPA粉末,充分溶解(摩尔比Cd Te:BSA-Gd3+-DTPA:EDC:NHS=1:15:4000:8000)。Na OH(1 mol/L)调p H值至8-9,室温反应2 h,得到Cd Te·BSA-Gd3+。低温超速离心纯化,85 000转/秒×30 min,除上清,重复3次,终产物分散于PBS(10 m M,p H=7.4),保存备用。4.Cd Te·BSA-Gd3+的表征:采用粒径分析仪检测量子点的粒径;透射电镜(TEM)观察量子点的形态及分布;荧光分光度计比较Cd Te量子点和Cd Te·BSA-Gd3+的光学性能;3.0T核磁共振成像仪测试Cd Te·BSA-Gd3+探针的弛豫性能及体外MR成像。结果:粒径分析仪及透射电镜结果显示近红外Cd Te量子点粒径约2.5~3.0 nm,形态为分布均一的球形颗粒;荧光分光度计测得Cd Te·BSA-Gd3+波长约729 nm,与Cd Te的741 nm相仿,达到近红外量子点标准,具有良好的光学性能,紫外灯下观察呈现像明亮的红色荧光;体外弛豫性能测得Cd Te·BSA-Gd3+的r1、r2为17.874×10-3L·mmol-1·ms-1和26.957×10-3 L·mmol-1ms-1,r2/r1值为1.515,为顺磁性纳米颗粒,可用于T1成像。体外MR成像显示随着Gd3+浓度的增加,Cd Te·BSA-Gd3+探针的T1加权信号逐渐增强。结论:所构建的非靶向Cd Te·BSA-Gd3探针,不仅具有近红外量子的光学特性,同时又有良好的弛豫性能,为构建针对CD133+胶质瘤干细胞的靶向探针奠定基础。第二部分靶向MRI荧光双模态探针对CD133+胶质瘤干细胞的体外成像研究目的:检测靶向MRI荧光双模态探针Cd Te·BSA-Gd3+·Ab在体外对SU2s细胞的靶向成像能力。材料和方法:1.细胞培养:SU2s细胞株为经证实CD133受体高表达的细胞株。将SU2s细胞株接种于无血清的DMEM/F12培养基中,并加入神经干细胞所需营养因子,37℃,5%CO2的培养箱中孵育。倒置显微镜观测细胞生长情况。2.细胞毒性实验:采用改良MTT法,比较Cd Te量子点和Cd Te·BSA-Gd3+·Ab对SU2s细胞的活力影响。3.Cd Te·BSA-Gd3+·Ab靶向性双模态探针的合成与纯化:按照1:15:4000的摩尔比加入Cd Te·BSA-Gd3+、CD133单克隆抗体和EDC·HCl偶联剂,低温反应2 h。反应产物通过高速离心分离纯化,得到的Cd Te·BSA-Gd3+·Ab溶解分散在PBS中。4.探针对SU2s细胞的靶向荧光成像研究:取对数期SU2s细胞与Cd Te·BSA-Gd3+、Cd Te·BSA-Gd3+·Ab共同孵育5、10、20、30 min后观察。5.探针对SU2s细胞的靶向MR成像研究:取对数期SU2s细胞分别与Cd Te·BSA-Gd3+、Cd Te·BSA-Gd3+·Ab、Gd-DTPA(马根维显)、生理盐水共同孵育30min,3.0 T磁共振观察并比较T1加权成像。结果:细胞毒性实验显示,Cd Te·BSA-Gd3+·Ab与Cd Te量子点相比,其细胞毒性作用有所降低。荧光显微镜下观测到Cd Te·BSA-Gd3+·Ab在SU2s细胞膜表面特异性聚集,而Cd Te·BSA-Gd3+分布无明显特异性。体外MR成像显示Cd Te·BSA-Gd3+·Ab组信号强于Cd Te·BSA-Gd3+及其它对照组。结论:构建的MRI荧光双模态探针Cd Te·BSA-Gd3+·Ab可在体外靶向识别SU2s细胞,并实现双模态成像,是一种良好的分子探针,为胶质瘤早期诊断和靶向治疗提供新途径。