非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是我国常见的慢性肝脏疾病之一,疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及肝硬化和肝细胞癌。NAFLD发生与高脂饮食、缺乏锻炼等不良的生活方式有关。有研究证实,高脂饮食诱导形成的NAFLD存在肠道菌群结构的改变,肠黏膜屏障功能受损。近年来,“肝-肠轴”学说、“多重打击学说”为寻找肝病的发病机制和诊疗方法提供了新思路。盐酸小檗碱(berberine,BBR)是从黄连、黄柏、三颗针中提取的异喹林生物碱,盐酸小檗碱具有广谱的抑菌作用,临床上主要作为非处方药治疗胃肠道炎症和细菌性痢疾。近年来研究发现,盐酸小檗碱有着改善胰岛素抵抗、治疗代谢综合征、降低胆固醇等作用。有研究证实盐酸小檗碱能改变肠道菌群的结构,进而能改善疾病的状态。本研究探讨盐酸小檗碱是否能通过调节肠道菌群结构改善肠黏膜屏障功能,从而达到治疗NAFLD的目的。目的:本实验通过高脂饮食建造NAFLD大鼠模型,研究盐酸小檗碱通过调节肠道菌群结构对NAFLD大鼠肠黏膜屏障起到保护作用,为盐酸小檗碱治疗NAFLD提供理论依据。方法:健康清洁级雄性SD大鼠33只(200g±10g),适应性喂养1周后,随机分为3组:正常对照组(normal control group,简称N组)、高脂模型组(high diet model group,简称M组)、盐酸小檗碱组(berberine group,简称B组),每组11只。其中,N组给予普通饲料喂养,M组及B组给予高脂饲料(脂肪含量59.8%)喂养,普通饲料及高脂饲料原材料均由河北医科大学实验动物中心提供。各组喂养12周后,每组处死1只,HE染色观察肝细胞脂肪沉积程度确定造模成功。造模成功后,N组继续给予普通饲料喂养,M组、B组继续高脂饲料喂养;B组给予150mg/(kg.d)盐酸小檗碱2ml灌胃,N组与M组给予等量的生理盐水灌胃,治疗过程中根据大鼠体重的变化调整用药量,连续灌胃4周后,即喂养16周后,隔夜禁食,麻醉状态下腹主动脉取血,测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、内毒素(Endotoxin)、D-乳酸、肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)水平;留取肝脏组织标本,HE染色观察肝脏病理学变化;取回肠末端肠组织行HE染色和扫描电镜观察肠黏膜绒毛的变化,透射电镜观察肠黏膜紧密连接的变化,留取大鼠新鲜粪便行高通量测序技术研究肠道菌群的变化情况。结果:1大鼠喂养12周时M组、B组大鼠体重较N组大鼠体重明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);M组和B组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色结果显示M组、B组大鼠肝细胞内可见脂肪沉积,证明造模成功;2大鼠喂养16周时,即盐酸小檗碱干预4周后,M组大鼠的体重较N组大鼠的的体重明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与M组大鼠相比,B组大鼠体重有所下降,两组相比差异有统计学意义(P<0.05);3大鼠血液指标结果:M组ALT、AST、TC、TG较N组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);与M组相比,B组大鼠血清ALT、AST、TC、TG明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。M组大鼠内毒素、D-乳酸、I-FABP较N组大鼠显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与M组相比,B组内毒素、D-乳酸、I-FABP有所下降,差异有统计学意义(P<0.05);4肝脏组织HE染色:与N组大鼠相比,M组大鼠肝小叶结构紊乱,肝细胞排列不齐,肝细胞肿大,肝细胞内充满大小不等的脂肪空泡,可见细胞核被挤向一边。经盐酸小檗碱治疗后B组大鼠肝细胞肿胀程度减轻,脂肪空泡较少,肝细胞排列较整齐;5肠组织HE染色:N组大鼠肠绒毛排列紧密,结构完整;M组肠绒毛变短、稀疏,局部有绒毛脱落;与M组相比,B组肠绒毛轻度水肿,排列较整齐、紧密;6肠黏膜扫描电镜结果:N组大鼠肠绒毛呈宽厚的叶片状,排列紧密、整齐。M组大鼠可见肠绒毛呈扁平状,排列稀疏,局部绒毛有断裂、倒伏。与M组相比,B组大鼠肠绒毛形态较饱满,排列比较紧密、整齐;7肠黏膜透射电镜结果:N组透射电镜下肠黏膜上皮细胞间靠腔面紧密连接比较长,结构清晰,连接缝隙小;M组肠黏膜上皮细胞间靠腔面紧密连接消失,连接缝隙增大;B组肠黏膜上皮细胞间靠腔面紧密连接存在,连接缝隙小;8粪便菌群高通量测序结果8.1序列分析结果M组Chao1指数与Shannon指数与N组相比有增高的趋势,但是差异无统计学意义。B组Chao1指数与Shannon指数均低于N、M组,差异有统计学意义(P<0.05),表明盐酸小檗碱对肠道菌群结构改变有重要作用;8.2物种累积曲线本实验中物种累积曲线上升平缓,表明样本量足够,可以估计群落丰富度;8.3大鼠粪便微生物的群落变化在门水平,N组、M组粪便菌群主要以厚壁菌门和拟杆菌门为主,均为总体的90%以上;B组中粪便菌群中此两种细菌比例约73%。与N组相比,M组厚壁菌门、变形菌门是增加的,拟杆菌门、蓝细菌门所占比例减少。与M组相比,B组粪便菌群中拟杆菌门、变形菌门所占比例均是增加的,而厚壁菌门、蓝细菌门是减少的,差异有统计学意义(P<0.05);在属水平,N组中前20种菌属占到整体菌属的92.5%,M组中前20种菌属占到整体菌属的94.3%,B组中前20种菌属占到整体菌属的94.8%。其中在N组中前3种优势菌属分别为乳杆菌属、普雷沃菌属、属于厚壁菌门中梭菌目中的未知菌属;M组中前3中优势菌属有两种属于厚壁菌门中梭菌目中的未知菌属,一种属于拟杆菌门中S24-7科中的未知菌属;B组中前3种优势菌属为拟杆菌属、属于拟杆菌门中S24-7科中的未知菌属、属于厚壁菌门中毛螺旋科中的未知菌属;与N组相比,M组中乳杆菌属、普雷沃菌属丰度是降低的,M组中丰度增加的菌属包括属于厚壁菌门中梭菌目中的未知菌属、毛螺旋科中的未知菌属、属于拟杆菌门中S24-7科中的未知菌属。与M组和N组相比,B组中拟杆菌属丰度是增加的,而属于拟杆菌门中S24-7科中的未知菌属、属于厚壁菌门中毛螺旋科中的未知菌属丰度是降低的,与N组相比其丰度是增加的,差异有统计学意义(P<0.05);结合以上结果得出结论,高脂饮食能诱导大鼠肠道菌群发生变化,其变化主要集中于肠道各分类水平中菌群的丰度变化,对肠道中总体菌群的种类改变较小;盐酸小檗碱能降低NAFLD大鼠粪便菌群的种类,使粪便菌群中富集拟杆菌门中的拟杆菌属,抑制属于厚壁菌门毛螺旋科和拟杆菌门S24-7科的菌属生长。结论:1高脂饮食喂养能诱导产生NAFLD大鼠模型,改变肠道菌群结构,损伤肠黏膜机械屏障。2盐酸小檗碱可以改善NAFLD大鼠内毒素血症,降低NAFLD大鼠体重、血脂,减轻肝脏脂肪变性程度,改善肝脏功能。3盐酸小檗碱能降低肠黏膜通透性,修复NAFLD大鼠肠黏膜机械屏障功能。4盐酸小檗碱能降低NAFLD大鼠肠道菌群的多样性,富集拟杆菌属,抑制毛螺旋科和S24-7科中菌属的生长。