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免疫层析试纸条因具有检测快速(5~15 min)、操作简单和成本低廉等特点,被广泛应用于现场快速检测。金纳米粒子作为经典的标记材料,易于合成及修饰,具有良好的生物兼容性以及裸眼判读的特性,是当前免疫层析方法的主流标记材料之一。传统的胶体金免疫层析试纸条(Colloidal gold immunochromtographic assay,GICA)一般采用粒径为20~40 nm的球形胶体金作为标记物,因其光学信号弱,GICA的灵敏度与其他免疫学检测方法相比,仍有很大差距,需进一步提高。相比于球形胶体金,同粒径的金纳米花摩尔消光系数更大,显色信号更强,以其作为信号载体,有利于提高试纸条的检测性能。此外,标记材料的粒径和硝酸纤维素(Nitrocellulose,NC)膜的孔隙率都将影响标记抗体在NC膜上的泳动速率,进而影响标记物与测试线、质控线上抗原或抗体的结合效率。因此本文旨在探讨标记材料的尺寸,以及NC膜的孔隙率对双抗夹心免疫层析试纸条检测性能的影响,从而提高其检测灵敏度。首先,探讨了不同粒径金纳米花对双抗夹心免疫层析试纸条检测灵敏度的影响。通过合成五种不同粒径的金纳米花(33、47、79、152、195 nm)作为抗体标记材料,以人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,HCG)为检测目标物,在金纳米花标记抗体光学强度一致的条件下,中等粒径的金纳米花(47~79 nm)对HCG的最低检测限(Limit of detection,LOD)为9 mIU/mL,检测灵敏度最高。以47 nm金纳米花为试纸条的标记材料,进行试纸条检测性能的评价,该方法在线性范围内检测HCG呈现两条相关的标准曲线,即低浓度的HCG(9~288 mIU/mL)满足线性回归方程y=0.4025 ln(x)-0.4483(R~2=0.9872),而HCG浓度介于288~2304 mIU/mL时,可根据线性回归方程y=1.0503 ln(x)-4.2393(R~2=0.9831)进行定量。该金纳米花试纸条检测HCG有显著的信号响应,对结构类似蛋白(黄体生成素、卵泡刺激素)信号响应微弱,检测其他干扰蛋白(癌胚抗原、牛血清白蛋白)时无信号响应;批次内、批次间的回收率分别为81.82%~102.87%和81.19%~114.44%,变异系数分别为3.29%~6.76%和3.87%~8.08%,说明47 nm金纳米花试纸条定量检测HCG具有良好的特异性和精密度。检测结果进一步与化学发光试剂盒(Chemiluminesecence immunoassay,CLIA)进行对比,结果显示两者有较好的相关性。其次,以79 nm金纳米花为标记物,建立了乙肝表面抗原(Hepatitis B surface Antigen,HBsAg)试纸条的定量检测方法,并探讨了NC膜孔隙率对金纳米花试纸条检测灵敏度的影响。在最优条件下,以CN170膜检测HBsAg的检测灵敏度最高,LOD达到1 ng/mL,线性范围在1~5000 ng/mL之间,满足线性回归方程y=0.0545 ln(x)+0.0023(R~2=0.9520,1 ng/mL≤x≤50 ng/mL)和y=0.3418 ln(x)-1.1563(R~2=0.9859,50 ng/mL≤x≤5000 ng/mL),而CN140、CN95膜的LOD分别为5 ng/mL和10 ng/mL。以上结果表明,在标记探针泳动良好的情况下,NC膜孔隙越小,金纳米花探针的泳动速率越慢,可提高抗原抗体间的结合效率,从而有利于提高试纸条的检测灵敏度。在60℃条件下进行金纳米花试纸条的加速保存实验,结果显示试纸条在室温环境至少可以保存两年。对大量HBsAg实际血清进行检测,由于金纳米花试纸条检测灵敏度更高,其相比于商业化胶体金试纸条,检测结果与CLIA的符合率高达87.5%,具有更高的检出率。