喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,占人体恶性肿瘤的1%-5%,发病率呈逐年上升趋势。90%的喉癌属于喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)。近年来,尽管综合外科手术,化学疗法和放射疗法的治疗策略已取得了最新的进展,但全球与LSCC相关的死亡率却并没有降低。一项统计数据显示,2018年全球共有177,422例新发喉癌病例和94,771例喉癌死亡病例,分别占新发癌症病例的1%和癌症死亡病例的1%。因此,寻找有效的能够早期诊断LSCC的分子标志物至关重要。蛋白质编码基因在恶性肿瘤的研究中取得了突破性的进展,为肿瘤的靶向疗法奠定了基础,例如伊马替尼治疗Bcr-Abl白血病或维拉非尼治疗BRAFV600E黑色素瘤。但是,在人类全基因组DNA中编码蛋白质的序列只占不到2%,正是大量的非编码基因才是癌症的驱动因素。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)是指长度超过200个核苷酸的一类功能性RNA分子,没有蛋白质编码能力,“非编码”表现在缺少或无开放阅读编码框(Open reading frame,ORF)。Lnc RNA具有组织和细胞特异性、表达和时空特异性以及调控多样性和低序列保守性等特征。近年来,大量深入的研究证实lnc RNA在多种生物学功能中发挥关键作用,包括X染色体沉默,基因组印迹,转录激活,转录干扰,核运输以及其他重要的调控过程。表观遗传学的改变在人类肿瘤的发生和发展中起着重要作用。由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)驱动的DNA甲基化被认为是表观遗传学改变的高频事件,也是调节基因表达水平变化的主要机制之一。启动子区DNA高甲基化导致抑癌基因的永久性失活是肿瘤发生的关键过程。DNA损伤修复基因,致癌基因以及与肿瘤代谢和侵袭有关的基因由于表观遗传学的改变导致表达水平的变化,都会促成肿瘤的发生和进展。在许多体细胞肿瘤中,启动子高甲基化可以作为第一次打击,然后以突变和缺失的形式作为第二次打击。本研究使用高通量芯片筛查检测了4对LSCC组织和正常组织中的转录本表达谱,筛选LSCC中差异表达的lnc RNAs。在这些差异表达的lnc RNAs中,一个全新的长链非编码RNA-LINC00886引起我们的关注。LINC00886位于3号染色体,在LSCC组织中的表达显著降低,且包含一个巨大的Cp G岛。因此我们猜测,LINC00886表观遗传学的改变可能是其低表达的原因之一。通过全面而详细的文献检索发现,LINC00886在LSCC中的表达及潜在的调控机制尚未见报道。本文旨在探讨LINC00886在LSCC中的表达及其与临床病理参数的关系,分析LINC00886启动子区甲基化状态,使用荧光素酶报告基因分析其对体外转录活性的影响及体内外功能实验研究其对细胞生物学行为的影响,预测下游作用的靶基因、参与的信号通路以及相关调控机制。本课题结果分为三部分进行汇报:第一部分LINC00886在喉鳞癌组织及细胞中的表达、甲基化状态及其与临床病理参数的相关性研究目的:研究LSCC组织及配对的癌旁正常组织以及喉鳞癌细胞系中LINC00886的表达情况,分析了LINC00886启动子区的甲基化状态以及甲基化对体外转录活性的影响,探讨LINC00886的表达以及其启动子区甲基化状态与临床病理参数的关系。方法:1.应用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)的方法检测LINC00886在62例LSCC组织及相应癌旁正常组织中以及在喉鳞癌细胞系(TU177、AMC-HN-8、TU686)中的表达情况。同时应用此方法检测LINC00886在使用DNMT抑制剂(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-d C)处理前后的喉鳞癌细胞系中表达情况。分析LINC00886在LSCC组织中的表达与临床病理参数之间的相关性。2.应用亚硫酸氢盐处理后基因组测序(bisulfite genomic sequencing,BGS)的方法检测了2株喉鳞癌细胞系(TU177、AMC-HN-8)中LINC00886三个区域(远端启动子区、近端启动子区、内含子区)的Cp G位点的甲基化状态。3.应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)方法分别检测了40例LSCC配对组织以及使用5-Aza-d C处理前后的3株喉鳞癌细胞系(TU177、AMC-HN-8、TU686)中LINC00886三个区域(远端启动子区、近端启动子区、内含子区,其中近端启动子区包含转录起始位点)的甲基化状态,并分析了其与临床病理参数的关系。4.应用双荧光素酶报告基因系统分析LINC00886启动子区甲基化对转录活性的影响。5.应用细胞核浆分离试剂盒,在AMC-HN-8、TU177以及TU686细胞中分别提取细胞核、细胞浆的RNA,应用q RT-PCR的方法检测细胞核、浆中LINC00886的亚细胞定位。结果:1.LINC00886在62例喉癌组织中的表达水平显著低于相应的癌旁正常组织(P<0.01)。LINC00886在3株喉鳞癌细胞系的表达显著降低(P<0.01)。LINC00886的表达与LSCC患者的病理分化程度相关(P<0.05),与患者的年龄、吸烟、临床分期和淋巴结转移等特征无相关性(P>0.05)。LINC00886在5-Aza-d C处理后的AMC-HN-8、TU177以及TU686三株喉癌细胞系中的表达水平均显著上调(P<0.01)。2.应用BGS的方法检测AMC-HN-8和TU177中LINC00886的近端启动子区及内含子区呈现高甲基化状态。s3.应用MSP方法检测的40例LSCC组织中,LINC00886的三个区域均呈现高甲基化状态,甲基化率均高于相应的癌旁正常组织,但只有在近端启动子区及内含子区二者的差异具有显著性。在40例LSCC组织中,LINC00886近端启动子区的甲基化率与病理分化程度相关(P<0.05)。其他区域的甲基化率与临床病理参数均无相关性。LINC00886近端启动子区的高甲基化率与其在LSCC组织中的表达呈现负相关(P<0.05)。LINC00886的近端启动子区及内含子区在AMC-HN-8、TU177以及TU686三株喉癌细胞系中呈现高甲基化状态,这种高甲基化状态可以被5-Aza-d C所逆转。4.双荧光素酶报告基因分析显示近端启动子区的高甲基化状态抑制转录活性。5.LINC00886主要定位表达在AMC-HN-8、TU177和TU686的细胞核中。第二部分LINC00886对喉鳞癌细胞生物学行为的影响目的:通过体内外实验,研究LINC00886对喉鳞癌细胞生物学行为的影响。方法:1.选择LINC00886表达较低的AMC-HN-8和TU177细胞用于后续实验。构建pc DNA3.1-LINC00886过表达载体,分别转染AMC-HN-8和TU177细胞,采用q RT-PCR的方法检测转染效率。2.应用MTS以及克隆形成实验检测过表达LINC00886后对两株喉癌细胞增殖能力的影响。3.应用Transwell小室迁移以及侵袭实验来检测过表达LINC00886后对两株喉癌细胞的迁移以及侵袭能力的影响。4.应用流式细胞术检测过表达LINC00886后对细胞周期的影响。5.应用体内实验-构建裸鼠移植瘤模型,将稳定转染pc DNA3.1-LINC00886的TU177细胞注射入裸鼠,观察LINC00886对移植瘤生长的影响。结果:1.在转染过表达载体pc DNA3.1-LINC00886的AMC-HN-8和TU177喉癌细胞中LINC00886的表达水平显著上调,显示载体构建成功。2.应用MTS及克隆形成实验证实过表达的LINC00886能够显著抑制喉癌细胞的增殖能力(P<0.01)。3.应用Transwell小室迁移以及侵袭实验证实过表达LINC00886后可显著抑制AMC-HN-8及TU177细胞的迁移、侵袭能力(P<0.01)。4.应用流式细胞术检测发现过表达LINC00886后显著抑制AMC-HN-8和TU177细胞的增殖,细胞被阻滞在G1期,增殖指数明显下降(P<0.01)。5.体内实验结果显示与对照组相比,过表达LINC00886后显著抑制了肿瘤的生长,降低了体内移植瘤的重量和体积(P<0.05)。第三部分预测LINC00886下游靶向调控的相关m RNA、参与的信号通路以及相关机制的研究目的:预测LINC00886在喉鳞状细胞癌中其下游靶向调控的m RNA以及可能参与的信号通路,探讨LINC00886对上皮间充质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)进程的影响。方法:1.使用喉癌细胞TU177转染pc DNA3.1-LINC00886过表达载体,应用q RT-PCR的方法检测转染效率。应用高通量测序技术筛选出过表达LINC00886后的差异表达m RNA。2.应用GO(Gene Ontology)分析对差异性基因进行功能描述;应用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析对差异基因进行信号通路富集分析。3.随机选取过表达LINC00886前后差异变化显著的基因(VEGFA、PIK3R2、COL4A1、DAPK2、EGR1、UNC5B),利用q RT-PCR的方法进行验证,并以此来证实高通量测序结果的准确性。4.应用q RT-PCR的方法验证AMC-HN-8及TU177细胞过表达LINC00886前后EMT相关的分子标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin)m RNA表达水平的变化。5.应用western blot的方法分析AMC-HN-8及TU177细胞过表达LINC00886前后EMT相关的分子标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin)蛋白表达水平的变化。结果:1.喉癌细胞TU177转染pc DNA3.1-LINC00886过表达载体后,LINC00886表达水平显著升高。高通量测序技术共筛选表达水平上调的基因429个,表达水平下调的基因255个。2.GO分析发现与LINC00886相关的基因主要富集在多细胞生物过程的正调控,细胞表面受体信号传导途径,氮化合物代谢过程的正调控等。KEGG Pathway分析显示,LINC00886可能参与了P53信号通路、氨基酸的生物合成信号通路、Fox O信号通路、VEGF信号通路以及TNF信号通路等。3.随机选取了六个差异性显著的m RNA(VEGFA、PIK3R2、COL4A1、DAPK2、EGR1、UNC5B)使用q RT-PCR进行验证,结果显示在过表达LINC00886前后,上述m RNA的变化与高通量测序结果一致,证实了高通量测序结果的准确性。过表达LINC00886后VEGFA、PIK3R2的表达水平显著下调而DAPK2的表达水平显著升高,而VEGFA、PIK3R2和DAPK2均富集在VEGFA/PI3K/AKT信号通路。提示LINC00886可能通过上述靶基因的介导参与了VEGFA/PI3K/AKT信号通路。查阅文献发现,VEGFA/PI3K/AKT信号通路通过三种重要机制促进肿瘤转移,包括血管生成,肿瘤细胞增殖和诱导EMT信号传导,从而导致肿瘤细胞的侵袭和转移。因此,我们在后续的试验中分别通过q RT-PCR和WB的方法评估了过表达LINC00886后EMT相关分子表达的变化。4.q RT-PCR结果显示在AMC-HN-8和TU177两株喉癌细胞中,过表达LINC00886后E-cadherin的m RNA表达水平显著上调,而N-cadherin、Vimentin、β-catenin的m RNA表达水平显著下调(P<0.05)。5.应用蛋白印迹实验进一步检测EMT相关分子标志物在蛋白水平的变化。在AMC-HN-8和TU177两株喉癌细胞中,过表达LINC00886后E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-catenin在蛋白表达水平与其在m RNA表达水平相一致。结论:1.LINC00886在喉鳞癌细胞系及喉鳞状细胞癌组织中表达下调,其低表达与肿瘤病理分化程度密切相关。2.LINC00886近端启动子区的异常高甲基化可能是其低表达的表观遗传学调控机制之一。3.LINC00886抑制喉鳞癌细胞的迁移、侵袭及体内外增殖,提示LINC00886在喉鳞癌中发挥着抑癌基因的作用。4.LINC00886可能参与了VEGFA/PI3K/AKT信号通路以及EMT的过程。