论文部分内容阅读
木糖醇和乙醇具有非常重要的应用价值。一方面,木糖醇在医学和食品等方面具有重要的应用价值,然而目前木糖醇的生产主要来源于化学生产,这就带来了低食品安全和环境污染等问题,利用微生物生产木糖醇可以解决化学生产带来的问题,因此利用微生物来生产木糖醇受到越来越多的关注。另一方面,液体燃料主要依赖于石油,然而有限的化石燃料和全球环境问题使人们的注意力集中在可持续发展的资源上,利用微生物来生产运输燃料等,可以满足当前和未来对运输燃料的需求,并且不会带来严重的环境问题。因此,发展利用微生物来生产生物乙醇的技术成为生产液体燃料的迫切需要。在利用木糖生产木糖醇方面。首先,我们对耐热的马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中的木糖还原酶基因(Xyl1)或者木糖醇脱氢酶基因(Xyl2)分别或同时敲除,再将脉孢霉的木糖还原酶基因(NcXyl1)或树干毕赤酵母的木糖还原酶基因(PsXyl1)在上述基因敲除的耐热酵母中分别表达,筛选出两个利用木糖生产木糖醇的能力大幅度改良,能够在较高温度下利用木糖大量生产木糖醇的耐热工程酵母菌株YZJ015和YZJ017。然后,我们在YZJ017的基础上尝试了马克思克鲁维耐热酵母水通道蛋白基因(KmFPS1),中间假丝酵母葡萄糖/木糖转运促进基因(CiGXF1)和中间假丝酵母葡萄糖/木糖转运基因(CiGXS1)的分别或同时重组表达,获得更高生产木糖醇能力的耐热工程酵母菌株YZJ074。最后,用于通过木糖发酵产生木糖醇的菌株为YZJ015和YZJ074。其中,YZJ015菌株可直接利用木糖发酵生产木糖醇,在42℃条件下,能在48h利用100g/L木糖生产71.46g/L木糖醇,生产速率为1.49g/L/h,生产率为0.83g/g；即使在45℃条件下,仍然可以在24h利用50g/L木糖生产35.59g/L木糖醇,生产速率为0.99g/L/h,生产率为0.78g/g。这比已报道的耐热酵母产量、速率都高很多。YZJ074用于利用木糖和协同底物甘油或者葡萄糖发酵生产木糖醇。在发酵罐中,YZJ074在42℃条件下,能分别利用99.55g/L和151.91g/L的木糖生产99.29g/L和149.60g/L的木糖醇,生产速率高达为4.14g/L/h和3.40g/L/h。即使在45℃条件下,仍然可以利用101.41g/L木糖生产101.30g/L木糖醇,生产速率为2.81g/L/h。除此之外,YZJ015的菌体循环利用木糖生产木糖醇的发酵策略,可以利用重复菌体发酵100g/L木糖,每16个小时可以生产71.35g/L的木糖醇,并且可以至少重复20次,生产速率高达4.43g/L/h,产率0.89g/g。因此可重复利用YZJ015菌体发酵,此技术应用到工业生产中后能节省大量的发酵时间,并且在短时间内具有很高的生产量,避免了准备发酵种子的时间与费用。而菌株YZJ074可以利用持续补料(补加的料无需灭菌直接添加使用)的方式利用发酵罐发酵生产木糖醇,最终木糖醇的生产量高达312.05g/L。在利用木糖生产乙醇方面。首先,将粗糙脉孢霉的木糖还原酶基因(Neurospora crassa NcXyll),树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶基因(Scheffersomyces stipitis PsXyl2)和白色假丝酵母的的木糖醇脱氢酶基因(Candida albicans CaXyl2)及其各种突变体,进行过表达,从而改善辅酶的不平衡。然后,过表达下游的一系列基因,提高利用木糖生产乙醇的能力。最后,通过3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1)的敲除降低甘油、乙酸等副产物的积累。最终得到的菌株YZJ088能通过木糖代谢路径在较高温度(>42-C)下,高效地利用和发酵木糖,大量快速生产乙醇。在42℃条件下,能利用118.39g/L木糖生产44.95g/L乙醇,生产速率高达2.49g/L/h。其产量和发酵速率都超过已报道的耐热菌株。不仅如此,YZJ088还可以利用葡萄糖和木糖共发酵,在42℃条件下,利用103.97g/L木糖和40.96g/L葡萄糖发酵产生51.43g/L乙醇,生产速率高达2.14g/L/h。综上所述,我们通过基因工程改造,最终分别得到了利用木糖生产木糖醇或乙醇的工程菌株YZJ015、YZJ074或YZJ088。它们不仅在较高温度(>42℃)条件下有利用木糖生产木糖醇或乙醇的能力,而且YZJ015、YZJ074与现有的已发表的利用酵母生产木糖醇相比,速率更快,产率和产量更高；YZJ088与目前已发表的耐热酵母利用木糖生产乙醇的最好水平相比,其产量和发酵速率也都超过已报道的耐热菌株。它们的构建为在工业上利用木糖生产木糖醇或乙醇提供了一个很好代谢路线改造思路和实际生产平台。