论文部分内容阅读
目的：缺血再灌注会对机体多种脏器(包括脾脏、肝脏和肾脏)造成损伤,使得组织中有大量炎症介质浸润,导致细胞大量凋亡。本研究(1)观察金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ (Metallothionein Ⅰ/Ⅱ,MT Ⅰ/Ⅱ)敲除(Knockout, KO)小鼠的饲养和繁殖过程；(2)采用左侧大脑中动脉闭塞法(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)建立WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血再灌注损伤模型,观察N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)和SOD活性抑制剂二硫代氨基甲酸(diethyldithiocarbamic acid, DETC)对脑缺血再灌注后脾细胞的抗氧化作用,从免疫的角度,初步探讨NAC和DETC对脾细胞作用的机制。方法：1.观察MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的饲养和繁殖过程。2.采用MCAO法建立WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血2h再灌注损伤模型。以假手术为对照,(1)采用五点法,评价WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血再灌注24h后神经功能缺陷情况；(2)观察缺血再灌注对小鼠脾脏脏体比和脑组织供血的影响；(3)采用MTT方法,检测WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血再灌注24h后脾细胞活力的变化,以及NAC干预2h和DETC处理2h对脾细胞活力的影响；(4)检测WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血再灌注24h时间点,脾细胞及脾细胞给予NAC处理2h和DETC处理2h后线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)开放程度；(5)检测WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血再灌注24h时间点,脾细胞及脾细胞给予NAC2h和DETC处理2h后线粒体Ca2+摄取释放情况；(6)用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)测定试剂盒,检测WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血再灌注24h后LDH漏出率的变化,以及NAC和DETC处理2h的作用。结果：1. MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠与野生鼠比较生殖能力要低一些,喜静,容易长肿物,对缺水耐受性低。2.NAC对脑缺血再灌注损伤MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞的影响(1)脑缺血再灌注24小时,WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠出现明显的神经功能缺陷。(2)缺血再灌注影响了小鼠脑组织的正常供血,导致部分缺血；且导致小鼠的脾脏体比下降,而金属硫蛋白在一定程度上抑制了缺血再灌注对脾脏体比的影响。(3)无论是WT还是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,与假手术对照组相比,缺血再灌注组对照组的脾细胞活力显著下降(P<0.01)；与缺血再灌注对照组相比,NAC干预后,脾细胞活力均显著增强(P<0.01)。与WT相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注后,脾细胞活力降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。而MT-Ⅰ/ⅡKO缺血再灌注后经过NAC干预后,脾细胞活力增加的强度比WT低,差异具有统计学意义(P<0.05)。DETC处理抑制了WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的脾细胞的活力(P<0.01)；DETC处理进一步抑制了WT(P<0.05)和MT-Ⅰ/Ⅱ KO(P<0.01)小鼠脑缺血再灌注后的脾细胞的活力；DETC对MT-Ⅰ/ⅡKO小鼠的抑制作用比对WT小鼠的大。(4)无论是WT还是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,与假手术对照组相比,缺血再灌注组的OD540值降低,mPTP开放程度增大(P<0.01)；与缺血再灌注对照组相比,缺血再灌注NAC处理组的OD540值增加,mPTP开放程度减小(P<0.01)。与WT缺血再灌注对照组相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注对照组的OD540值降低,mPTP开放程度增大,差异具有统计学意义(P<0.05)。而MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注NAC处理组的OD540值比WT缺血再灌注NAC处理组的低,差异具有统计学意义(P<0.05)。DETC处理对WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠假手术组和缺血再灌注组的mPTP开放程度均没有显著影响(P>0.05)。(5)无论是WT还是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,与假手术对照组相比,缺血再灌注组的OD值增高,Ca2+超载程度加深(P<0.01)；与缺血再灌注对照组相比,缺血再灌注NAC处理组的OD值降低,Ca2+超载程度较低(P<0.01)。与WT缺血再灌注对照组相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注对照组的OD值较高,Ca2+超载程度加深,差异具有统计学意义(P<0.01)。而MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注NAC处理组的OD值、Ca2+超载程度比WT缺血再灌注NAC处理组的高,差异具有统计学意义(P<0.01)。DETC处理对WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠假手术组和缺血再灌注组的Ca2+超载程度均没有显著影响(P>0.05)。(6)无论是WT还是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,与假手术对照组相比,缺血再灌注组的乳酸脱氢酶漏出率增高(P<0.01)；与缺血再灌注对照组相比,缺血再灌注NAC处理组的乳酸脱氢酶漏出率降低(P<0.01)。与WT缺血再灌注对照组相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注对照组的乳酸脱氢酶漏出率较高,差异具有统计学意义(P<0.01)。而MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注NAC处理组的乳酸脱氢酶漏出率比WT缺血再灌注NAC处理组的高,差异具有统计学意义(P<0.01)。DETC处理促进了WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的乳酸脱氢酶的漏出(P<0.01)；DETC处理进一步促进了WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脑缺血再灌注后的乳酸脱氢酶的漏出(P<0.01)；DETC对MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的作用比对WT小鼠的大。结论：1.MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的饲养需注意保持环境清洁,防止缺水及环境不干净而诱发肿瘤的产生。2.脑缺血再灌注后对脾脏周围免疫器官脾脏的细胞具有影响,抗氧化剂MT和NAC对脑缺血再灌后的脾脏周围免疫器官脾脏的细胞具有保护作用。SOD活性抑制剂DETC加重了脑缺血再灌注对脾细胞活力的抑制作用和细胞损伤,但对线粒体肿胀无显著影响。