多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是一种导致育龄女性不孕的高发的内分泌代谢性疾病,临床表现为稀发排卵或无排卵、卵巢多囊样改变及高雄激素血症。卵泡发育障碍是临床PCOS患者不孕的重要原因之一,改善卵泡发育障碍是PCOS防治的重要策略。PCOS患者临床表现异质性强,多数均伴有肥胖、胰岛素抵抗等临床指征,胰岛素抵抗可进一步加重高雄激素血症,是PCOS患者卵泡发育障碍的重要影响因素。因此,研究增强胰岛素敏感性改善卵泡发育的机制对临床PCOS患者的防治具有重要意义。卵泡正常发育主要依赖颗粒细胞摄取葡萄糖经糖酵解途径生成乳酸作为能量来源。糖酵解进程受其关键限速酶如己糖激酶（hexokinase,HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase M,PKM）及乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）的调控。胰岛素抵抗可下调颗粒细胞中糖酵解关键限速酶的表达;同时,PCOS患者卵巢颗粒细胞的胰岛素敏感性降低,卵泡液中乳酸含量减少,糖酵解进程受阻。因此,探讨改善胰岛素抵抗调控颗粒细胞糖酵解进程的作用可为临床PCOS患者卵泡发育障碍的防治提供坚实的理论基础和新的策略。白藜芦醇（Resveratrol,RES）是一种天然的非黄酮类多酚化合物,可发挥多种药理学作用。研究显示,白藜芦醇对改善2型糖尿病患者胰岛素抵抗有显著疗效;同时在恢复PCOS患者紊乱的月经周期、提高其体外培养卵母细胞及胚胎的质量发挥重要作用。结合前期研究基础,本课题拟提出如下科学假设:白藜芦醇可否通过增强胰岛素敏感性,促进颗粒细胞糖酵解进程,进而发挥改善PCOS卵泡发育障碍的作用。本研究拟开展两个部分的实验研究:第一部分,构建PCOS大鼠模型并采用白藜芦醇干预,阐释白藜芦醇改善PCOS大鼠胰岛素抵抗和卵泡发育障碍的作用;第二部分,结合能量代谢组学、转录组学和体外培养颗粒细胞等实验技术,揭示白藜芦醇增强胰岛素敏感性调控PCOS卵巢颗粒细胞糖酵解进程的作用机制。第一部分白藜芦醇增强胰岛素敏感性改善PCOS卵泡发育目的:阐释白藜芦醇改善PCOS大鼠胰岛素抵抗和卵泡发育障碍的作用。方法:采用来曲唑灌胃联合高脂饲料喂养构建PCOS大鼠模型,白藜芦醇进行灌胃干预,试验过程中监测各组大鼠体重、动情周期的变化;采用放射免疫法检测各组大鼠血清生殖激素水平;石蜡切片结合HE染色观察卵巢卵泡发育形态学改变;合笼试验分析白藜芦醇干预对PCOS大鼠生育力的影响。血糖试纸监测各组大鼠空腹血糖水平,放射免疫法检测胰岛素水平,结合q PCR、Western Blotting及免疫组化等实验技术检测各组卵巢组织中IGF1及IGF1R的表达变化,分析白藜芦醇对PCOS大鼠胰岛素敏感性的影响。结果:1.与对照组相比,PCOS大鼠体重显著增加,动情周期紊乱,血清睾酮水平显著升高;HE染色结果显示,PCOS大鼠卵巢囊性卵泡数量显著增加,黄体数量减少;合笼实验结果表明,PCOS大鼠生育力较对照组相比显著降低。与PCOS大鼠模型相比,白藜芦醇干预后,PCOS大鼠的体重、睾酮水平显著降低,动情周期趋于对照组,降低了卵巢中囊性卵泡数量,增加了黄体数量及其生育力,表明白藜芦醇干预可显著改善PCOS大鼠卵泡发育障碍。2.与对照组相比,PCOS大鼠血清胰岛素水平、空腹血糖水平显著升高,胰岛素抵抗指数增加;q PCR及Western Blotting检测发现PCOS大鼠卵巢组织中IGF1的表达上调,IGF1R的表达下调;免疫组化结果显示PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中IGF1阳性细胞数较Ctrl组明显增多,IGF1R阳性细胞数减少,提示PCOS大鼠卵巢发生了胰岛素抵抗,胰岛素敏感性降低。与PCOS大鼠模型相比,白藜芦醇干预后,PCOS大鼠胰岛素抵抗指数降低,抑制了卵巢中IGF1的表达,促进IGF1R的表达,增强了胰岛素敏感性。小结:白藜芦醇可增强PCOS大鼠卵巢组织胰岛素敏感性,改善PCOS大鼠卵泡发育。第二部分白藜芦醇增强胰岛素敏感性调控颗粒细胞糖酵解进程目的:揭示白藜芦醇增强胰岛素敏感性调控颗粒细胞糖酵解进程的作用机制。方法:靶向能量代谢组学分析卵巢糖代谢产物水平变化;转录组筛选并分析各组大鼠卵巢差异表达基因;通过q PCR、Western Blotting及免疫组化等实验技术检测糖酵解关键限速酶基因HK2、PKM2、LDHA及其调控因子SIRT2的表达情况,探讨白藜芦醇调控糖酵解进程的作用机制。在KGN细胞中分别添加胰岛素和SIRT2抑制剂AGK2的同时,采用白藜芦醇干预;CCK-8法检测细胞活力的变化;ELISA检测细胞乳酸、丙酮酸产量的变化;q PCR及Western Blotting检测细胞HK2、PKM2、LDHA及SIRT2的表达差异,揭示白藜芦醇增强胰岛素敏感性调控颗粒细胞糖酵解进程的作用机制。结果:1.靶向能量代谢组学结果发现,与对照组相比,PCOS大鼠卵巢糖代谢紊乱,糖酵解代谢产物乳酸水平显著降低,丙酮酸水平显著升高,白藜芦醇干预后乳酸水平升高,丙酮酸水平降低;卵巢转录组结果显示,与对照组相比,共有876个基因在PCOS和白藜芦醇干预后的卵巢中差异表达;GO和KEGG富集分析发现,多个差异表达基因富集于糖酵解通路,q PCR及Western Blotting检测后发现HK2、PKM2、LDHA及SIRT2的m RNA水平在PCOS卵巢中表达显著下调,白藜芦醇干预后表达显著上调;免疫组化结果显示HK2、PKM2、LDHA及SIRT2的阳性颗粒细胞在PCOS卵巢中显著减少,白藜芦醇干预后显著增加,暗示白藜芦醇干预调控糖酵解进程与改善PCOS大鼠卵泡发育障碍密切相关。2.CCK-8及ELISA法检测结果发现,在体外培养的KGN细胞中,高水平的胰岛素可抑制细胞的活力,降低乳酸的产量、提高丙酮酸水平,白藜芦醇干预后上述现象得到逆转;q PCR及Western Blotting实验结果显示,高水平的胰岛素可抑制细胞中HK2、PKM2、LDHA及SIRT2的表达,白藜芦醇干预后可显著上调上述因子的表达;同时在添加SIRT2特异性抑制剂AGK2处理细胞后,可显著抵消白藜芦醇改善高胰岛素水平抑制细胞糖酵解进程的作用,表明白藜芦醇可激活SIRT2改善高水平胰岛素抑制细胞糖酵解进程。小结:白藜芦醇可增强胰岛素敏感性,进而激活SIRT2促进PCOS颗粒细胞的糖酵解进程。结论:白藜芦醇可增强PCOS大鼠卵巢胰岛素敏感性,激活SIRT2并促进颗粒细胞糖酵解进程,发挥改善PCOS大鼠卵泡发育障碍的作用。