研究背景随着科技、经济、医疗水平日新月异的发展,人们对健康、疾病防范的意识日渐提高;同时伴随着日常生活习惯及饮食结构的改变,高血压、糖尿病、高脂血症和人口老龄化问题的不断出现,心血管疾病的发病率呈现逐年增长的趋向。心肌梗死(MI),在病理上被定义为由于持续的血流、养分中断导致心肌细胞发生坏死,是目前临床上死亡率最高的内科疾病之一,其中MI后恶性心律失常及其并发症是心源性猝死(SCD)的罪魁祸首。目前认为MI后室性心律失常(VAs)的发生主要与交感激活、炎症聚集、心脏局部电机械重构、离子通道的变化及儿茶酚胺类物质大量释放相关,但目前临床仍无特效药物及措施进行有效防治。尽管急症冠状动脉支架植入术、溶栓技术、除颤起搏器植入术、射频消融术等先进医疗技术已广泛应用于临床各大医院;胸痛中心的成立也为MI患者尽早开通罪犯血管提供了良好的诊治平台,但仍有平均4.8-46人/年/100万人死于SCD。同时临床上抗心律失常药物的应用均有其明确的限制性、禁忌症及其致心律失常的副作用,如可达龙的肝功、甲功的毒副作用,也可导致QT间期延长,因此VAs的防治仍是目前临床工作的重点。动物实验研究发现,神经节阻滞术、消融术等手术能有效降低外周交感神经张力,同时减少MI后VAs的发生率,能够有效缓解约60%顽固性心绞痛病人的症状,这一手术治疗方案也已应用于临床,获得良好的临床效果,但因手术难度大,仍缺乏大规模临床试验,目前尚未全面开展,因此交感神经张力调控可能成为MI后恶性VAs的防治的重要靶点。中枢神经系统(CNS),是人体最高级的神经中枢,参与信息的传递、整合、调控,也参与各种疾病病理生理过程的调控。其中,CNS对外周交感神经系统的调控已被广泛认知。下丘脑室旁核(PVN)位于第三脑室下丘脑部的上端两侧,被称为“交感流出道”,是心血管活性的调控中枢。有研究证实,心衰大鼠、自发性高血压大鼠PVN内交感神经元显著激活,继而激活外周交感神经系统,在循环系统中的表现为异常升高的心率(HR)、血压(BP)、外周去甲肾上腺素(NE)水平和肾交感活性(RSNA)。有报道指出PVN内PI3K/AKT信号通路被激活且参与调控交感神经元的活性,抑制这一信号通路可以降低外周交感活性、可以有效降低BP,但具体机制仍不明确。因此我们猜测,PVN中的PI3K/AKT信号通路在MI后交感神经活性的调控中扮演着重要角色,且靶向干预这一通路可以防治MI后恶性VAs的发生。研究目的我们旨在明确MI后PVN中PI3K/AKT通路的激活情况,同时利用LY294002(PI3K抑制剂)抑制PI3K活性评价大鼠梗死面积、心功能、NE水平、RSNA及心律失常易感性等相关指标,探讨PVN对MI后外周交感活性的调控机制。研究方法1、动物模型建立实验雄性大鼠给予戊巴比妥钠诱导麻醉后,固定头部,利用脑立体定位仪将双极套管植入到大鼠PVN,牙科水泥固定,分笼饲养,恢复期给予抗生素肌注避免感染。予以7天恢复期,后将PVN套管植入术后大鼠随机分为4组:A组:假手术组+DMSO、假手术组指前降支近端穿线不结扎;B组:假手术组+LY294002;C组:MI+DMSO,MI造模指前降支近端穿线结扎;D组:MI+LY294002。行分组及MI造模后,DMSO、LY294002均利用微量注射泵向双极套管内泵入给药,每侧PVN每次给药计量为100nl,连续给药7天。2、心律失常易感性分析MI后7天,大鼠处死前,在呼吸机支持下,连接大鼠心电记录系统,开胸行程序性电刺激测定大鼠心律失常的诱发率及心律失常易感性评分。3、血流动力学检测微导管插入大鼠颈动脉后,利用Power-Lab系统获取HR、左室收缩末压(LVESP)、左室舒张末压(LVEDP)、射血分数(EF)、左室内压上升最大速率(±dp/dtmax)、左室内压下降最大速率(±dp/dtmin)等数值反应大鼠血流动力学指标。4、RSNA测定大鼠取右侧卧位,左腰腹部纵行切开,暴露肾脏,分离左侧肾交感神经,测定大鼠RSNA放电情况。5、血压测定大鼠清醒状态下,利用尾套法血压测定仪测量大鼠尾动脉的收缩压、舒张压,连续测量三次并取平均值。6、Elisa大鼠处死前收集血液于采血管中,室温静置2小时后离心取上清;分离大鼠梗死灶周组织匀浆收集上清,行Elisa检测NE水平的变化。7、组织形态学实验大鼠给予多聚甲醛全身灌注后,立即摘取脑组织、心脏组织,制备石蜡切片。心脏组织行Masson染色明确大鼠心梗造模成功与否,同时测定大鼠心梗面积,心梗面积在30%-50%的大鼠满足入组标准。脑组织切片后行免疫组化实验测定大鼠PVN内Fra-Li阳性神经元的表达情况。8、、Western Blot分离各组大鼠的PVN,检测PVN内p-PI3Kp85、总-PI3K、p-AKT、总-AKT、GAPDH的蛋白表达水平明确P13K/AKT通路的激活情况。研究结果1、LY294002可降低PVN内交感活性免疫组化染色提示,MI导致PVN内Fra-Li染色的阳性神经元数量较假手术组明显增多,MI组大鼠给予LY294002干预后,可见PVN中Fra-Li阳性神经元数量较MI+DMSO组大鼠下降趋势明显(128±4.68 vs 197.4±14.4,p<0.05),具有统计学差异,表明抑制P13K/AKT通路可降低PVN内交感神经元活性。2、LY294002干预对血流动力学的影响同两组假手术组大鼠相比,MI+DMSO、MI+LY294002组大鼠的+dp/dtmax、-dp/dtmin、EF值明显降低,同时HR显著上升,表明MI导致大鼠心功能下降;MI+LY294002组与MI+DMSO组相比,两组大鼠的+dp/dtmax、-dp/dtmin、EF 无明显差异,表明LY294002干预不能改善MI大鼠的心功能。3、LY294002干预改善外周交感活性Elisa实验表明,MI+DMSO组大鼠外周血、MI心肌灶周组织匀浆的NE表达量是假手术组的2-3倍(血浆NE,89.42±11.21 vs 26.61±1.03和25.53±0.93 pg/ml;心肌NE,27.36±2.08 vs 14.09±1.20和13.74±1.74 pg/mg,p<0.05)。PVN中靶向注射LY294002后,大鼠血浆NE水平(37.17±3.73 vs 89.42±11.21 pg/ml,p<0.05),梗死灶周NE水平(20.01±1.45 vs 27.36±2.08 pg/mg,p<0.05)较MI+DMSO组明显下降。两组假手术组大鼠的RSNA水平相比并无显著差异,而MI+DMSO组的RSNA水平较两组假手术组明显升高(0.13±0.01 vs 0.06±0.01和0.06±0.01 uv.s,p<0.05),表明MI手术导致外周交感神经过度激活,且与MI+DMSO组相比,MI大鼠给予LY294002治疗后的RSNA水平被显著抑制(0.09±0.01 vs 0.13±0.01 uv.s,p<0.05),表明抑制PVN内的PI3K/AKT通路可降低MI后异常升高的交感活性。4、LY294002干预降低心律失常易感性假手术组+DMSO、假手术组+LY294002、MI+DMSO、MI+LY294002 四组大鼠的心律失常诱发率分别为:12.5%、12.5%、75%、40%,;两组假手术组心律失常易感性评分接近0分,MI+DMSO组大鼠易感性评分为易感性评分为3.3±0.96分,而MI+LY294002组大鼠为1.4±0.62分,结果表明MI后大鼠心律失常易感性及诱发率明显增加,PVN靶向注射LY294002后可降低VAs的易感性。5、PI3K/AKT信号通路表达水平MI导致PVN内PI3K、AKT蛋白的相对表达水平明显升高,其中MI+DMSO组的p-PI3K/总-PI3K水平是假手术组大鼠的2倍(0.79±0.06 vs 0.40±0.04和0.44±0.03),p-AKT/总-AKT是假手术组大鼠的1.5倍(0.88±0.05 vs 0.59±0.06和0.53±0.03,p<0.05),表明MI导致PVN内的PI3K/AKT信号通路被激活。和MI+DMSO组相比,LY294002干预的MI大鼠可以显著下调p-PI3K/总-PI3K的蛋白表达水平(0.58±0.04 vs 0.79±0.06,p<0.05)和 p-AKT/总-AKT 表达水平(0.61±0.01vs 0.88±0.05,p<0.05)。研究结论本实验证实PVN内交感神经元活性、外周交感神经系统在MI模型中被过度激活。且靶向抑制PI3K/AKT信号通路可以降低PVN交感活性,从而改善外周交感张力,有效降低VAs的发生率。研究背景颈上神经节(SCG)是颈部最大的交感神经节,通常位于第1,2颈椎或2,3颈椎高度,呈现长梭形,主要接收来自脊髓节段节前神经元,并进行换元后发出节后纤维到达相应组织及器官发挥调控作用,其发出的心上神经与颈中神经节、星状神经节发出的心中神经、心下神经共同组成了心丛,共同支配心脏的电生理活动。其中动物实验证实SCG参与了心肌梗死(MI)后心脏自主神经的调节,这一调控作用已广泛应用于临床,如目前神经节消融、神经节阻滞术已用于临床难治性心绞痛的治疗,并能缓解60%的心绞痛症状,但其具体机制仍不明确。γ-氨基丁酸(GABA)是目前研究较为深入的重要的抑制性神经递质,参与调控多种疾病的病理生理,如帕金森、焦虑、失眠、高血压等。GABA通过结合离子型的GABAA受体(GABAAR)和GABAB受体(GABABR)发挥其抑制性生理作用。其中,室旁核(PVN)内的GABA与兴奋性神经递质互相协调、互相拮抗,共同参与心脏自主神经功能的调控。PVN内GABA失调与高血压、心衰、心律失常等心血管疾病的发生密切相关,同时大脑特殊核团内GABAAR表达上调可导致交感神经元活性下降。近年来研究发现GABA系统在外周组织、器官(如肝、胰腺、胃肠道、输卵管、心血管系统等)中均发挥了其重要生理作用。实验动物发现,通过口服补充外源性GABA可以使高血压大鼠的血压(BP)平均下降20.8±3.5mmHg,但对于健康大鼠无明显降压作用,这可能与交感张力异常升高有关,表明了外周GABA对BP具有明确的调节作用。尾静脉注射GABA可以阻断乌头碱所诱发的室性早搏和室性心动过速,表明了外周神经系统中GABA能系统对心血管的调控作用。既往研究已经证实SCG内存在GABA能信号系统的表达,但目前对于SCG内的GABA能系统的生理、病理研究较为缺乏,我们旨在探讨GABA能系统与心脏交感活性之间的关系及潜在的分子机制。研究目的构建MI模型,探讨外源性GABA对心血管功能的调控作用及SCG中GABA能信号系统是否参与MI后交感神经活性的调控,同时明确GABA能系统是否通过P2X7/AKT通路调控去甲肾上腺素(NE)释放降低MI后VAs的发生率,为临床新药物的开发及治疗提供干预靶点及理论基础。研究方法实验一为了探究外源性GABA的心血管调控作用,我们将SD大鼠随机分成三组:假手术组,MI组,MI+外源性GABA组,外源性GABA溶解于饮用水中,,予以灌胃,GABA计量为500mg/kg/天,余两组大鼠予以等量饮用水,不添加任何药物。MI组大鼠行冠状动脉前降支结扎造模,造模前12小时给予GABA预处理,假手术组穿线不结扎。MI术后7天,实验大鼠均通过程序性电刺激反应大鼠心律失常易感性及其评分、小动物遥测检测心率变异性;行肾交感活性测定(RSNA)反应外周交感活性;小动物心室压力容积系统测定血流动力学指标反应心功能等在体实验;取心脏组织环石蜡切片行Masson染色,明确梗死面积并统计(梗死面积30-50%的才能符合入选标准);取双侧SCG行Western Blot测定GABAAR的表达量变化,取外周血、梗死灶周心肌组织行Elisa测定NE的变化。实验二探讨SCG中的GABA能系统是否参与MI后心律失常的调控。首先制备GABAARβ2 shRNA病毒,并利用微量注射器将其靶向注射到双侧SCG中,4天后分离SCG行冰冻切片观察病毒是否有效感染,并行qRT-PCR检测病毒效力,根据上述实验结果择优选取病毒行动物实验。实验大鼠随机分成4组:假手术组+ Vehicle(病毒通过微量注射器靶向注射到SCG中,注射过程中避免损伤神经),假手术组+GABAARβ2 shRNA病毒,MI+Vehicle,MI+GABAARβ2 shRNA病毒,病毒注射后大鼠给予4天的恢复期,后行MI造模手术。MI后7天测定实验大鼠的RSNA、血浆NE、心律失常易感性等指标,并取SCG行qRT-PCR、Western blot、免疫组化等实验。实验三探讨GABA能系统发挥抗心律失常作用的分子机制。在显微镜下急性分离胎鼠SCG神经元并行原代培养,培养4天后行免疫荧光染色明确P2X7受体(P2X7R)和GABAARβ2在酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元中的分布及定位;利用钙成像技术,分别给予ATP、GABA受体激动剂(muscimol)+ATP、GABA受体拮抗剂(SR 95531)+muscimol +ATP等不同处理,选择488nm的激发光,通过检测神经元内荧光强度来反应不同给药处理前后的细胞内Ca2+浓度的变化。研究结果1、心电图、心脏大体观、Masson染色等结果证实MI造模成功,选取梗死面积在30-50%范围的大鼠入组,结果显示MI及MI+GABA组大鼠MI面积无明显差异,说明GABA对MI面积无改善作用。研究还发现,MI组大鼠外周血、梗死灶周的NE水平较假手术组显著升高,且给予GABA干预后可使NE水平明显降低。MI组大鼠行程序性电刺激,假手术组心律失常诱发率仅为10%,其易感性评分接近于0分。MI组心律失常的诱发率为80%,其易感性评分为3.1±0.8。MI+GABA组大鼠心律失常的诱发率较MI组大鼠明显降低,诱发率为50%,且其易感性评分较MI组明显下降,具有明确的统计学差异(1.4±0.5 VS 3.1±0.8,P<0.05)。RSNA检测同样发现,MI大鼠的RSNA积分、基线水平异常升高,MI+GABA组的RSNA积分、基线水平较MI组明显降低,且具有统计学意义。外周NE、RSNA等指标反应MI后外周交感活性过度激活,外源性GABA可有效改善过度激活的交感活性。血流动力学研究结果提示,给与GABA干预的MI大鼠的±dP/dt、左室射血分数值较MI组明显升高,表明GABA可改善大鼠心功能。Western Blot结果显示,与MI组大鼠比,MI+GABA组SCG中GABAARβ2的表达升高,提示外源性GABA可能通过SCG内GABAAR发挥作用。2、本研究制备了GABAARβ2 shRNA,靶向注射到SCG后,根据Western Blot和qRT-PCR实验结果选取最优病毒。行MI造模后,相关实验表明:MI+GABAARβ2 shRNA病毒组在模型制备过程中,死亡率较MI+vehicle组明显升高,心电图提示大鼠均死于恶性心律失常。MI 7天后取材,行相关实验,结果示:MI+GABAARβ2 shRNA病毒组大鼠外周血NE、RSNA的基础值、心律失常诱发率、心律失常易感性评分较MI组显著升高。这一结果表明了 SCG内的GABA能系统参与了 MI后心血管活性的调控。3、SCG免疫荧光双染色提示,GABA合成酶GAD65/68的表达主要位于TH阳性的交感神经元的胞体上,提示TH阳性神经元也能合成GABA。原代SCG神经元免疫荧光双染结果提示:P2X7受体和GABAARβ2在TH阳性神经元上均表达。钙成像结果示,ATP处理后,神经元胞内Ca2+浓度显著升高,这一现象可以被GABA受体激动剂muscimol所抑制。而加入GABA受体抑制剂(SR 95531)+muscimol+ATP后,可以轻度逆转muscimol的抑制作用,引起细胞内Ca2+浓度有所回升,表明GABA通过P2X7/AKT信号通路参与交感神经元胞内Ca2+浓度的调控。研究结论GABA能信号系统在SCG的交感神经元中表达,系统性给予GABA干预后,可降低外周交感活性,降低MI后VAs的发生率。而SCG中GABAARβ2敲除后进一步恶化了 MI所致的异常升高的RSNA、NE、心律失常易感性,进一步证实了 SCG内的GABA能系统参与了交感活性的调控。同时通过细胞实验证实GABA调控外周交感活性可能是通过抑制P2X7R,从而降低细胞内Ca2+浓度,抑制NE的释放。因此,GABA系统通过P2X7/AKT通路调控NE释放,从而降低MI后VAs的发生率,为临床心律失常的防治提供潜在靶点及理论基础。